高鵬飛，李娜，景引軍

1陜西省第四人民醫(yī)院影像科，西安 710043

2西安唐城醫(yī)院影像科，西安 710032

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，易出現(xiàn)早期侵襲及轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高的原因，可嚴(yán)重影響患者的生存率。因此，提高早期診斷準(zhǔn)確率，早期給予有效的免疫治療十分必要[1-2]。黏蛋白1（mucin 1，MUC1）也稱為多態(tài)性上皮黏蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白與多種腫瘤相關(guān)，MUC1是其中重要的成員，可在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤組織中異常表達(dá)[3]。肝癌作為多血管性腫瘤，血管生成是其惡性生物學(xué)行為的基礎(chǔ)。有研究表明，存活蛋白（survivin）在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用，可促進細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[4]。微血管密度（microvessel density，MVD）是目前評估腫瘤血管生成的有效指標(biāo)[5]。MUC1、survivin及MVD均為肝癌的早期診斷指標(biāo)。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，CT灌注成像（CT-perfusion imaging，CTPI）逐漸應(yīng)用于臨床，在各種腫瘤診斷中發(fā)揮重要作用[6]。為評估CTPI對肝癌的早期診斷價值，本研究分析肝臟CTPI參數(shù)與MUC1、survivin及MVD間的關(guān)系，以評估CTPI對肝癌血管生成及分化程度的診斷效能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年6月陜西省第四人民醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實為原發(fā)性肝癌；②臨床資料完整；③均在術(shù)前行CTPI檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在檢查禁忌證；②影像學(xué)圖像質(zhì)量差；③合并其他惡性腫瘤；④檢查前進行放療、化療、介入治療、免疫治療等。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入73例原發(fā)性肝癌患者，其中男45例，女28例，年齡38～71歲，平均（46.25±6.18）歲；分化程度：高分化10例，中分化49例，低分化14例。取73例原發(fā)性肝癌患者的肝癌組織和至少15 mm處癌旁正常組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 CTPI 檢查方法

采用GE 16排多層螺旋CT，檢查前去除患者身上所有影響掃描的金屬異物，患者平躺于掃描床上，取仰臥位。先行定位掃描，選取相應(yīng)的序列掃描上腹部。掃描參數(shù)：管電壓為120 kV，管電流采用自動毫安秒技術(shù)，掃描層厚7 mm，層距7 mm，螺距1.375∶1，視野25 cm×25 cm。行平掃和增強掃描，在平掃后使用雙筒高壓注射器，以5 ml/s速率經(jīng)肘靜脈注入非離子型對比劑碘普羅胺注射液50 ml，等滲鹽水 40 ml，延遲掃描時間 13～16 s，雙期或三期掃描。掃描完成后利用相關(guān)圖像處理工作站，選擇感興趣區(qū)（region of interest，ROI），選擇ROI時需避開壞死區(qū)，肝實質(zhì)ROI選擇時需避開大血管分支，病灶組織的ROI需要離病灶1 cm以上。測量各部位ROI的CT值，生成對應(yīng)的時間-密度曲線（time-density curve，TDC），獲得灌注參數(shù)圖。灌注參數(shù)包括：總肝灌注量（total liver perfusion，TLP）、肝動脈灌注量（hepatic artery perfusion，HAP）、肝動脈灌注指數(shù)（hepatic artery perfusion index，HAI）、門靜脈灌注量（hepatic portal vein perfusion，HPP）等，由2名專業(yè)醫(yī)師進行評估。

1.3 免疫組化法檢測MUC1、survivin表達(dá)情況及MVD

MUC1、survivin及MVD的檢測采用免疫組化法，選取73例原發(fā)性肝癌患者的肝癌組織和至少15 mm處的癌旁正常組織，石蠟包埋，5 μm切片，連續(xù)切3張，其中2張用于免疫組化染色。免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（streptavidin-peroxidase，SP）法進行檢測，標(biāo)本均經(jīng)微波法抗原修復(fù)。滴加MUC1單克隆抗體、兔抗人survivin多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體（用于MVD），4℃下孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下分別孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色1～3 min；蘇木素復(fù)染、脫水、透明封片后進行光鏡觀察。以空白實驗代替陰性對照，保證特異性與可靠性。

結(jié)果判定：MUC1主要定位于細(xì)胞膜，以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；survivin主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色判定為陽性；將與周圍組織有明顯區(qū)別的任何棕色染色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為MVD，記錄5個高倍鏡（×200）視野下的值，取平均數(shù)。MUC1、survivin陽性表達(dá)情況根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞所占比例進行評估，染色強度評分：無著色計0分，淺棕黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，深棕黃色染色計3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進行評分：陽性細(xì)胞所占比例≤5%計0分，＞5%且≤25%計1分，＞25%且≤50%計2分，＞50%且≤75%計3分，＞75%計4分。將染色強度評分與陽性細(xì)胞所占比例評分相加，≤2分判定為陰性，＞2分判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；CTPI灌注參數(shù)與MUC1、survivin、MVD的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 灌注參數(shù)的比較

肝癌組織中HPP、TLP均明顯低于癌旁正常組織，HAP、HAI均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 肝癌組織和癌旁正常組織中CTPI灌注參數(shù)的比較（±s）

表1 肝癌組織和癌旁正常組織中CTPI灌注參數(shù)的比較（±s）

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2.2 MUC1、survivin及MVD表達(dá)情況比較

肝癌組織中MUC1、survivin陽性表達(dá)率和MVD均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 肝癌組織和癌旁正常組織中MUC1、survivin及MVD表達(dá)情況的比較

2.3 CTPI灌注參數(shù)與MUC1、survivin及MVD的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，HAP與survivin、MUC1、MVD均呈正相關(guān)（P＜0.01）；HPP、TLP與survivin、MUC1、MVD均無相關(guān)性（P＞0.05）；HAI與MVD呈正相關(guān)（P＜0.01），但與MUC1、survivin均無相關(guān)性（P＞0.05）。（表3）

表3 CTPI灌注參數(shù)與MUC1、survivin及MVD的相關(guān)性分析

2.4 典型病例

患者男，80歲，上腹部CTPI增強掃描顯示，肝Ⅶ段、肝Ⅷ～Ⅳ段呈現(xiàn)2個不均質(zhì)團塊影，病變最大截面積分別為5.4 cm×4.8 cm、4.7 cm×5.1 cm；動脈期病灶呈明顯不均勻強化，中間斑片狀低密度區(qū)無強化，病灶周圍可見多發(fā)大小不等的環(huán)形強化影；門靜脈期病灶內(nèi)對比劑退出洗脫明顯。（圖1）

圖1 上腹部CTPI 增強掃描圖像

3 討論

MUC1屬于Ⅰ型跨膜蛋白，正常情況下，MUC1在正常腺細(xì)胞中表達(dá)很低，主要分布于腺細(xì)胞表面或以分泌形式存在于腺腔內(nèi)，不會被免疫系統(tǒng)識別[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MUC1在多種腫瘤中屬于抗黏附因子，可抑制細(xì)胞黏附，但E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)可促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8]。此外，也有研究顯示，腫瘤細(xì)胞侵襲性增強與MUC1的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[9]。survivin作為抑制凋亡蛋白家族成員，可選擇性地在腫瘤組織中表達(dá)，在正常組織中幾乎不表達(dá)，具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。血管內(nèi)皮生長因子是目前已知最強的促血管生成因子，有研究提出，survivin對肝癌血管生成的作用可能是因其可介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子從而促進了腫瘤血管生成[11]。MVD是血管生成的重要評價指標(biāo)[12]。

目前，彩超、核素、MRI灌注成像、CTPI等無創(chuàng)檢查是評估肝臟血流變化的主要影像學(xué)方法。其中CTPI的重復(fù)性好，可有效反映病變部位的血流動力學(xué)特征，提高對微小病灶檢出率及對血管的顯示能力；此外，CTPI可減少運動偽影影響，一次即可獲得灌注成像、血管重建、增強檢查等多個任務(wù)；此外，CTPI可利用后期專業(yè)軟件分析，避免病變位置及范圍影響所獲得的血流灌注信息，成為評估肝腫瘤血管生成情況及其活性的首選檢查方式[13-14]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中HPP、TLP均明顯低于癌旁正常組織，HAP、HAI均明顯高于癌旁正常組織，所得結(jié)果與肝癌臨床及病理認(rèn)知相符，HAP、HAI增高與以下3方面有關(guān)：①血管增多增粗；②新生血管基底膜不完整導(dǎo)致對比劑外滲增加；③灌注量增加[15]。肝癌患者多伴有肝硬化或門靜脈高壓，導(dǎo)致向肝性血流減少，門靜脈至肝動脈的分流增加，且由于某些血管活性物質(zhì)導(dǎo)致門靜脈血管阻力增加導(dǎo)致HPP下降。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）下降可能是因為肝硬化狀態(tài)下肝動脈緩沖效應(yīng)低下、門靜脈血供減少且無法被肝動脈血供代償所致[16]。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中MUC1、survivin陽性表達(dá)率和MVD均明顯高于癌旁正常組織，提示MUC1、survivin可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，且與MVD可能有一定關(guān)系。本研究分析MUC1、survivin、MVD與CTPI灌注參數(shù)的相關(guān)性顯示，HAP與survivin、MUC1、MVD均呈正相關(guān)（P＜0.01），HAI與MVD呈正相關(guān)（P＜0.01），提示CTPI灌注參數(shù)在一定程度上可反映腫瘤微循環(huán)狀況及腫瘤血管生成因子的表達(dá)情況，從而為評估腫瘤血管生成提供參考依據(jù)。

綜上所述，肝癌患者肝臟CTPI灌注參數(shù)與MUC1、survivin及MVD可能有關(guān)，可為腫瘤血管生成及相應(yīng)生物學(xué)行為提供實時、無創(chuàng)的評價，為早期診斷、治療方案擬訂提供參考依據(jù)。