張志衡，陳振家，李玉娥，王曉聞，張雪冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030800）

豆腐是世界上最受歡迎的大豆產(chǎn)品之一。其通過大豆浸泡、研磨、過濾、加熱、凝固和成型等工藝制成，在整個(gè)過程中，大豆蛋白發(fā)生變性、解離和聚集等行為，形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠體系[1]。凝固劑是豆腐凝膠形成的關(guān)鍵，據(jù)文獻(xiàn)記載[2]，當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂?%時(shí)，通過一定的熱處理即可形成凝膠，但當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊陀?%時(shí)，僅通過加熱無法形成凝膠，需借助凝固劑的促凝作用才能形成，豆?jié){中的蛋白濃度低于8%，因此在豆腐的制備過程中必須添加凝固劑。根據(jù)凝固機(jī)理，豆腐凝固劑大致可分為三類，即鹽類凝固劑、酸類凝固劑和酶類凝固劑。鹽類凝固劑制備所得豆腐表面光滑、產(chǎn)率高，具有濃濃的豆香味，但保質(zhì)期短且持水性較差；酶類凝固劑制備所得豆腐彈性好、口感細(xì)膩、無異味，但其硬度偏軟，且成本高；酸類凝固劑制備所得豆腐質(zhì)地細(xì)滑、保水性強(qiáng)和彈性好等優(yōu)點(diǎn)，但豆腐會(huì)帶有酸味[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵后得到的發(fā)酵液（即酸漿）可以作為凝固劑點(diǎn)制豆腐，即為酸漿豆腐，酸漿豆腐保水性好、質(zhì)地細(xì)膩，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且制作過程未引入鈣、鎂等金屬離子，產(chǎn)生的黃漿水經(jīng)過自然發(fā)酵作為凝固劑再次利用，避免了對(duì)環(huán)境造成危害，因此酸漿豆腐是一種綠色健康無污染的豆制品。關(guān)于酸漿凝固機(jī)理的報(bào)道不多，有研究發(fā)現(xiàn)[7]，酸漿中乳酸含量越高，制備的酸漿豆腐乳香味越濃，宋蓮軍等[8]在研究有機(jī)酸對(duì)豆腐品質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，用乳酸點(diǎn)制的豆腐品質(zhì)優(yōu)于其他單一有機(jī)酸，將單一有機(jī)酸復(fù)配為混合凝固劑時(shí)，最優(yōu)配比也是以乳酸為主，宋俊梅等[9]對(duì)酸漿成分研究后發(fā)現(xiàn)，在排除了蛋白質(zhì)、灰分等影響外，確定了酸漿豆腐的凝固機(jī)理為酸凝，但是由于沒有研究灰分的成分，沒有考慮到灰分中可能存在的金屬離子（Ca2+、Mg2+）在蛋白凝膠形成中的貢獻(xiàn)，Qiao等[10]發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵酸漿中的有機(jī)酸多為L(zhǎng)-乳酸，證明了乳酸菌是酸漿中的主要微生物。綜上所述，我們可以推測(cè)酸漿豆腐凝固機(jī)理主要是酸漿中乳酸菌和有機(jī)酸凝固作用，還可能涉及到鹽類凝固機(jī)理，因此對(duì)酸漿豆腐的凝固機(jī)理還需要做進(jìn)一步的研究。

在酸漿豆腐加工中，影響豆腐凝膠特性的因素很多，包括豆水比、煮漿方式、點(diǎn)漿溫度、酸漿品質(zhì)及用量等，其中，酸漿是影響豆腐品質(zhì)的關(guān)鍵因素[11]。目前對(duì)酸漿的研究主要集中在酸漿中微生物的分離與鑒定方面[12]，而對(duì)酸漿豆腐凝膠特性的研究很少，本試驗(yàn)旨在通過不同添加量的酸漿來控制豆腐的凝固過程，探究不同凝固劑添加量下酸漿豆腐凝膠特性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，市售；酸漿，大同廣靈神泉豆制品有限公司[pH 3.9，酸度=4.14（以乳酸計(jì)）]；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、無水乙醇、β-ME、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、過硫酸銨、低分子量蛋白標(biāo)樣、四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯化鈉、尿素，分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

自分離磨漿機(jī)，無錫市太湖城電氣有限公司；單盤電子加熱器、成型機(jī)，天思食品機(jī)械有限公司；TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó) Food Technology Corporation；DYY-7C型電泳儀，北京市六一儀器廠；可見分光光度計(jì)，上海菁華科技有限儀器公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋、磁力加熱攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；HC-2064高速離心機(jī)、大容量低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電動(dòng)玻璃均質(zhì)機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CM-5型色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)；Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker；JSM-7500F冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸漿豆腐的制備

根據(jù)Kamizake[13]、Khoder等[14]的方法并加以改進(jìn)來制備酸漿豆腐。具體步驟為：大豆清洗3次，室溫下浸泡12 h，瀝干水分后，將大豆與水按1:5（m/V）磨漿，粗漿200目過篩去除豆渣后，加熱煮沸5 min，冷卻至85 ℃后加入酸漿凝固，酸漿添加量分別為：20%、23%、26%（V/V），85 ℃水浴保溫10 min（蹲腦），所得豆花轉(zhuǎn)移至模具中，壓制成型（60 MPa，30 min），將壓制好的豆腐切割成適宜大小，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)性的測(cè)定

將制備好的豆腐切成4 cm×4 cm×1 cm的立方體，采用質(zhì)地多面剖析法（TPA）測(cè)定豆腐質(zhì)構(gòu)特性[15]。測(cè)試參數(shù)如下：測(cè)試速度：60 mm/s，測(cè)試后速度：200 mm/s，探頭回升高度：15 mm，擠壓距離：5 mm，測(cè)試間隔：3 s，起始力：0.4 N；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定10次。

1.3.3 酸漿豆腐得率、含水量及保水性的測(cè)定

按照Kang等[16]的方法測(cè)定豆腐得率，將制作好的豆腐于室溫下靜置5 min后稱重，計(jì)算100 g干大豆所得豆腐的質(zhì)量即為豆腐得率。

式中：

W1——豆腐質(zhì)量；

W2——干大豆質(zhì)量。

參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法[17]測(cè)定豆腐的含水量（MC）。

根據(jù)王睿粲等[18]的方法來測(cè)定豆腐的保水性。使用一種特殊的帶有內(nèi)管的50 mL離心管，內(nèi)管底部成網(wǎng)狀，在內(nèi)管中放入一張濾紙片，稱取濾紙片和內(nèi)管的質(zhì)量m1，稱取約1 g豆腐放在濾紙上，然后稱此時(shí)內(nèi)管的質(zhì)量m2，3500×g離心10 min后，稱內(nèi)管的質(zhì)量m3，豆腐的保水性按照如下公式測(cè)得：

1.3.4 酸漿豆腐中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5-2016[19]。

1.3.5 酸漿豆腐凝膠作用力的測(cè)定

參考Gómez-Guillén等[20]的方法。用小刀切取3 g豆腐凝膠放入研磨器內(nèi)分別與20 mL的0.05 mol/L NaC1（SA）、0.6 mol/L NaC1（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.2 mol/Lβ-ME（SE）破碎均質(zhì)，定容后10000×g離心10 min。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。離子鍵的貢獻(xiàn)以溶解于SB溶液與SA溶液中蛋白質(zhì)含量之差來表示，氫鍵的貢獻(xiàn)以溶解于SC溶液與SB溶液中蛋白質(zhì)含量之差來表示，疏水性相互作用的貢獻(xiàn)以溶解于SD溶液與SC溶液中蛋白質(zhì)含量之差來表示，二硫鍵的貢獻(xiàn)以溶解于SE溶液與SD溶液中蛋白質(zhì)含量之差來表示。

1.3.6 SDS-PAGE電泳

樣品制備：準(zhǔn)確稱取5 mg豆腐加入樣品處理液（0.4% SDS、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8、2%溴酚藍(lán)、尿素）中，加蒸餾水補(bǔ)充至總體積1 mL，震蕩混勻后冷藏備用；液體樣品的添加量根據(jù)其蛋白濃度確定，使最終溶液中的蛋白濃度調(diào)整至1 mg/mL；

SDS-PAGE電泳采用Backman等[21]的方法，制得的分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，上樣量6 μL，恒壓電泳，電流為40 mA，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V。電泳完畢，固定2 h，染色3 h，脫色2 h，結(jié)束后拍照成像，并分析圖譜。

1.3.7 掃描電子顯微鏡分析

根據(jù)Guo等[22]的方法制備樣品。將制備好的豆腐切成2 mm×2 mm×1 mm的形狀，用2.5%的戊二醛溶液4 ℃下固定14 h，用磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 7.2）洗三次，每次20 min，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液脫水，然后在液氮中冷凍，并進(jìn)行真空冷凍干燥。將干燥的樣品粘在樣品臺(tái)上，在樣品表面噴金，掃描電子顯微鏡（10 kV）下觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Shin等[23]的方法來測(cè)定樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將生豆?jié){、熟豆?jié){及豆腐冷凍干燥成粉。稱取凍干樣品10 mg，加入1 g KBr，在研缽中研磨均勻，使用壓片機(jī)將混合物壓成透明片狀（壓力：10 MPa，時(shí)間：1 min），準(zhǔn)備完成后進(jìn)行測(cè)定。波長(zhǎng)范圍設(shè)定為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)：24次；利用Peakfit軟件對(duì)圖譜進(jìn)行基線校正、去卷積和高斯擬合處理，根據(jù)峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用各子峰面積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.0和Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS軟件分析不同處理間的差異性，顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸漿添加量對(duì)豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響

質(zhì)地特性是評(píng)價(jià)酸漿豆腐品質(zhì)的重要方法之一，質(zhì)構(gòu)儀可以模仿口腔咀嚼，客觀反映豆腐的質(zhì)構(gòu)特性，對(duì)豆腐質(zhì)構(gòu)分析中常采用的是二次壓縮實(shí)驗(yàn)，即將樣品壓縮至一定距離后，返回至不與樣品接觸的位置，重復(fù)第一次下壓過程，獲得應(yīng)力隨時(shí)間的變化曲線，即TPA曲線[12]，選擇硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性四個(gè)參數(shù)，凝膠硬度反應(yīng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)械力的感應(yīng)，可以用來表征凝膠結(jié)構(gòu)抵抗外力壓縮的能力，它反映了蛋白分子間相互作用的強(qiáng)弱和成鍵數(shù)目的多少；凝膠彈性是去除外力后樣品恢復(fù)至原始狀態(tài)的能力，反映了凝膠抗形變能力的強(qiáng)弱；內(nèi)聚性定義為產(chǎn)品抵抗第一次變形相對(duì)于其抵抗第二次變形的程度，咀嚼性定義為將固體食物咀嚼到可吞咽的狀態(tài)所需要的能量，凝膠的質(zhì)構(gòu)特性直接影響到食品品質(zhì)。

由表1可知，隨著酸漿添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性顯著增大（p＜0.05），豆腐的質(zhì)地由松軟變得堅(jiān)硬。有研究指出[24]，豆腐的質(zhì)構(gòu)特性是大豆蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性的外在表現(xiàn)，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)構(gòu)建的強(qiáng)弱取決于參與蛋白數(shù)量和凝膠形成方式。不同酸漿添加量會(huì)影響等量豆?jié){中釋放H+的多少，這直接會(huì)導(dǎo)致形成豆腐的質(zhì)構(gòu)特性差異。酸漿添加量越大，參與凝膠形成的大豆蛋白越多，其硬度和咀嚼性也會(huì)逐漸增大。彈性和咀嚼性也呈現(xiàn)出和硬度相同的變化趨勢(shì)，說明隨著酸漿添加量的增加，酸漿豆腐的抗變形能力隨之增強(qiáng)，形狀恢復(fù)能力提高；作為凝膠內(nèi)部結(jié)合強(qiáng)度的指標(biāo)，內(nèi)聚性可用來模擬豆腐凝膠的強(qiáng)弱[25]，酸漿豆腐的內(nèi)聚性整體偏小且隨酸漿添加量的增加無顯著性變化（p＞0.05），表明酸漿豆腐凝膠通常較弱且一定范圍內(nèi)的酸漿添加量對(duì)其幾乎無影響，這與Cao等[26]的研究結(jié)果一致。整體來看，酸漿添加量對(duì)于豆腐的硬度、彈性和咀嚼性均有顯著影響，而對(duì)豆腐的內(nèi)聚性影響不大。

表1 酸漿添加量對(duì)豆腐質(zhì)構(gòu)性的影響Table 1 Effect of physalis addition on texture of tofu

2.2 不同酸漿添加量對(duì)豆腐含水量與保水性的影響

圖1為酸漿添加量分別為20%、23%、26%制作的豆腐含水量、得率和保水性的測(cè)定結(jié)果。豆腐含水量定義為壓制成型的鮮豆腐中水分所占比例；豆腐得率定義為一定質(zhì)量的干大豆制得的豆腐的質(zhì)量，它主要反映了豆?jié){中的蛋白向豆腐凝膠轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化率的高低；對(duì)于凝膠體系而言，凝膠保水性是指蛋白質(zhì)凝膠保留水分的能力，它不僅決定凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)膩程度，還關(guān)系到相關(guān)食品品質(zhì)[27]。由圖1可知，隨著酸漿添加量的增加，豆腐的含水量、保水性和得率都呈逐漸降低趨勢(shì)，酸漿添加量從20%提高至23%時(shí)，含水量幾乎不變（p＞0.05），但當(dāng)添加量達(dá)到26%時(shí)有明顯的降低（p＜0.05）；豆腐得率與其含水量變化一致，均顯著降低（p＜0.05）。酸漿中含多種有機(jī)酸，其中乳酸和醋酸含量較多，相比鹽類凝固劑和無機(jī)酸，酸漿釋放H+的速率較慢，而H+的緩釋在一定程度上有利于豆腐凝膠結(jié)構(gòu)形成的有序性，因此相比鹵水豆腐，酸漿豆腐具有較高的含水量和得率。另外，20%酸漿添加量在豆腐制作過程中具有緩慢酸化作用，而隨著酸漿添加量增加，由于大豆蛋白的加速聚集，可能會(huì)形成粗糙的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)水分的截留能力降低，因此酸漿添加量對(duì)豆腐含水量和得率有較大影響[25]。也有研究證實(shí)，豆腐得率與其含水量呈正相關(guān)[28]。

2.3 酸漿豆腐蛋白組成的測(cè)定

酸漿豆腐形成過程中，通過H+誘導(dǎo)熱變性大豆蛋白構(gòu)建三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成蛋白質(zhì)凝膠。豆腐內(nèi)部物理空間中所截留液體中仍存在部分可溶蛋白。因此，評(píng)價(jià)豆腐凝膠形成過程中參與蛋白質(zhì)的多少就有兩方面考量。一是未被凝膠網(wǎng)絡(luò)截留流失到黃漿水中的蛋白，二是被截留但保持可溶狀態(tài)的蛋白。

如圖2所示為酸漿豆腐中蛋白含量與可溶性蛋白含量隨酸漿添加量的變化趨勢(shì)，酸漿豆腐中的蛋白質(zhì)含量約占豆腐總量的13%～16%，其余主要成分為水分和油脂，隨著酸漿添加量的增加，酸化速率加快，過快的凝膠形成速度導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的快速聚集和大聚集體的形成，因而使得豆腐凝膠中的蛋白質(zhì)含量不斷提高，同時(shí)，由于蛋白含量的提高，蛋白凝膠中的蛋白分子相互作用增加，分子間作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致豆腐的硬度和咀嚼性提升。在豆腐凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中還存在尚未參與凝膠結(jié)構(gòu)形成的蛋白，即可溶性蛋白，可溶性蛋白在酸漿豆腐中的含量很少，約占總蛋白的2%～4%，說明豆腐中大多數(shù)蛋白都參與了豆腐凝膠的形成，隨著酸漿添加量的增加，可溶性蛋白含量逐漸降低；酸漿豆腐中總蛋白含量的提高和可溶性蛋白含量的降低表明酸化速率的提高有助于促進(jìn)大豆蛋白強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。

2.4 酸漿豆腐凝膠作用力的測(cè)定

在形成酸漿豆腐凝膠的過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化，在這一過程中可能伴隨分子間作用力的變化，從而形成不同的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即有序聚集。酸漿豆腐中維持蛋白結(jié)構(gòu)的作用力主要包括疏水作用、氫鍵、二硫鍵和離子鍵，在這些作用力的綜合影響下，凝膠達(dá)到平衡狀態(tài)[29]；使用不同酸漿添加量制備的豆腐，可能涉及到不同的化學(xué)作用力，且不同作用力對(duì)豆腐凝膠的貢獻(xiàn)也有所不同，因此，量化這些分子間作用力的貢獻(xiàn)有助于我們從分子角度解釋酸度對(duì)于酸漿豆腐某些凝膠特性的影響。各作用力在酸漿豆腐中的貢獻(xiàn)如圖3所示，二硫鍵和疏水作用是維持蛋白結(jié)構(gòu)的主要作用力，而氫鍵和離子鍵只參與少部分蛋白凝膠的形成，這與Zheng等[30]的研究結(jié)果相同。隨著酸漿添加量的增加，二硫鍵含量逐漸增加，Yang等[31]研究表明，低靜電作用可能會(huì)促進(jìn)二硫鍵的形成，隨著H+的增加，豆?jié){pH逐漸接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的靜電力降低，蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露出來，釋放出的巰基氧化成二硫鍵；疏水作用隨酸漿添加量的增加呈下降趨勢(shì)，說明在較低的酸度（20%酸漿添加量）下，由于酸化速度較慢，促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用，這與Cao等[26]的研究結(jié)果相符。離子鍵和氫鍵也參與了豆腐凝膠的形成，金楊等[32]的研究表明，隨著點(diǎn)腦溫度的升高，凝膠體系的離子鍵和氫鍵含量大幅下降，蛋白質(zhì)分子鏈展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，這是85 ℃下制備的豆腐中氫鍵和離子鍵貢獻(xiàn)較低的主要原因，此外，酸化也可能干擾了離子鍵和氫鍵的形成；值得一提的是，雖然酸漿豆腐中氫鍵和離子鍵含量很低，但它們?nèi)匀皇堑鞍踪|(zhì)凝膠形成的必要作用力[30]。

由上述作用力的分析可以推測(cè)酸漿豆腐的形成過程大致分為兩步，第一步，大豆蛋白在加熱條件下變性，維持蛋白構(gòu)象的作用力（離子鍵、氫鍵、二硫鍵等）發(fā)生斷裂，內(nèi)部疏水集團(tuán)和巰基暴露，由于此時(shí)豆?jié){pH高于大豆蛋白的等電點(diǎn)，蛋白分子表面帶有較多的負(fù)電荷，因此分子間產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電斥力，蛋白質(zhì)分子難以聚集；第二步，隨著酸漿的加入，H+迅速擴(kuò)散，蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷被中和，分子間的靜電斥力減弱，大量巰基氧化形成二硫鍵，而蛋白質(zhì)分子依靠疏水作用、二硫鍵等分子間作用力相互結(jié)合達(dá)到平衡，最終構(gòu)成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.5 SDS-PAGE

對(duì)比圖4a、4c中的3、6、9泳道可知，酸漿豆腐中可溶性蛋白的亞基條帶較少，主要由11S的A亞基和一條30 ku亞基組成，并且隨酸漿添加量的增加條帶逐漸變淺，對(duì)比2、5、8泳道和4、7、10泳道可知，豆腐中亞基條帶與豆腐中不溶性蛋白的亞基條帶相近，隨著酸漿添加量的增加條帶均逐漸加深，結(jié)合圖2中豆腐蛋白含量的測(cè)定結(jié)果可得到以下結(jié)論：在酸漿豆腐凝膠形成過程中，少量A亞基被包裹在凝膠內(nèi)部，未參與蛋白凝膠的形成；豆腐蛋白凝膠主要由11S的A、B亞基和7S的α、α′、β亞基組成；酸漿添加量的增加促進(jìn)了豆腐中可溶性蛋白向凝膠網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)化，且改變了蛋白的亞基組成；由圖4b可知，酸漿豆腐在SA、SB、SC、SD中的蛋白亞基條帶（B、A、β、α、α′）逐漸加深，說明在凝膠形成過程中有離子鍵、氫鍵和疏水作用的參與，在SA、SB、SC三種溶液中條帶很少且主要由11S蛋白亞基組成，而在SD溶液中亞基條帶大量增加且以7S蛋白亞基為主，結(jié)合圖3酸漿豆腐凝膠作用力分析結(jié)果可知，疏水作用是酸漿豆腐中7S蛋白參與凝膠的主要作用力，而離子鍵和氫鍵在豆腐形成過程中貢獻(xiàn)值相對(duì)較低且主要是由11S蛋白的A亞基參與；對(duì)比4a、4c兩圖發(fā)現(xiàn)，加入巰基乙醇后，B亞基條帶顏色加深和A3亞基條帶的出現(xiàn)，可以得出豆腐凝膠形成過程中，B亞基和A3亞基主要是通過二硫鍵參與，大于100 ku的聚集體由多種蛋白亞基組成，加入巰基乙醇后逐漸消失，說明這些聚集體之間也是通過二硫鍵連接。隨著酸漿添加量的增加，豆腐中11S亞基條帶增加，表明11S亞基在凝膠中的參與度提高，經(jīng)研究證實(shí)，11S/7S與豆腐凝膠的質(zhì)地密切相關(guān)[33]，11S/7S的增加有助于提升豆腐凝膠的硬度、彈性等質(zhì)構(gòu)特性，與酸漿豆腐質(zhì)構(gòu)性的測(cè)定結(jié)果吻合；對(duì)比4b、4d兩圖可知，加入巰基乙醇后，酸漿豆腐在SA、SB、SC三種溶液中的亞基組成基本不變，而SD溶液中大于97.4 ku的亞基條帶逐漸消失，11S亞基增加，新的亞基條帶（A3亞基）出現(xiàn)，說明由于穩(wěn)定蛋白分子結(jié)構(gòu)的二硫鍵斷裂，11S的酸性多肽和堿性多肽發(fā)生解離，形成了單個(gè)的亞基。

SDS-PAGE電泳的結(jié)果與豆腐蛋白含量及分子間作用力的測(cè)定結(jié)果基本吻合，表明二硫鍵和疏水作用是維持酸漿豆腐蛋白結(jié)構(gòu)的主要作用力，其中疏水作用是穩(wěn)定7S蛋白構(gòu)象的主要作用力，二硫鍵則是構(gòu)成11S蛋白結(jié)構(gòu)的主要作用力；酸漿添加量對(duì)豆腐中可溶性蛋白的亞基組成有一定影響。

2.6 掃描電子顯微鏡測(cè)定結(jié)果

有研究表明[34]，有機(jī)酸豆腐理化性質(zhì)的變化與不同的微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。不同酸漿添加量制作的豆腐凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示，由圖可知，蛋白質(zhì)在化學(xué)鍵的作用下結(jié)合為聚集體，聚集體相互纏繞形成網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)，網(wǎng)絡(luò)間的孔隙可以起到截留豆腐凝膠中水分的作用，從微觀角度展現(xiàn)了酸漿豆腐的形成過程。用較低酸漿添加量（20%、23%）制備的豆腐與用較高酸漿添加量（26%）制備的豆腐相比，顯示出更小的顆粒和更加細(xì)膩的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能是由于酸化速率和酸堿度的差異造成的，酸漿用量的增加導(dǎo)致大豆蛋白的快速聚集，有助于蛋白的局部凝膠化和更大的蛋白聚集體的形成，從而導(dǎo)致形成的蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)粗糙且分布不均勻，事實(shí)上，在低酸漿添加量下制備的豆腐內(nèi)部細(xì)膩的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有助于提高豆腐的保水性和得率[23]，而用26%酸漿制備的豆腐的表面結(jié)構(gòu)粗糙，從微觀角度解釋了豆腐的質(zhì)地隨酸漿添加量的變化規(guī)律，同時(shí)也反映出高酸漿添加量會(huì)使豆腐的質(zhì)量變差。

2.7 紅外光譜測(cè)定結(jié)果

大豆蛋白質(zhì)凝膠體系是決定豆腐品質(zhì)最重要的因素之一。趙雷等[35]發(fā)現(xiàn)在豆腐凝膠形成過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生了重要的變化，尤其是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；Pietrzak等[36]認(rèn)為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有密切的關(guān)聯(lián)性。因此，本試驗(yàn)利用傅里葉變換紅外光譜研究酸漿豆腐制備過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并構(gòu)建傅里葉去卷積處理后的圖譜。圖6為豆?jié){與酸漿豆腐的紅外光譜圖，主要由九個(gè)波峰組成，不同波峰對(duì)應(yīng)不同的基團(tuán)，例如3250～3400 cm-1（1號(hào)峰）歸屬于羥基基團(tuán)，脂肪族氨基酸殘基分別在2800～3000 cm-1（2、3號(hào)峰）和1440～1465 cm-1（7號(hào)峰）附近歸屬于C-H拉伸和彎曲模式[37]。在酸漿豆腐制備過程中，脂肪族氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的峰面積隨著酸漿添加量的增加而增大，由于亮氨酸、纈氨酸等脂肪族氨基酸通常位于大豆蛋白分子內(nèi)部，這些基團(tuán)的增加表明蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸向表面展開，蛋白質(zhì)聚集的趨勢(shì)增大。

有研究表明，蛋白質(zhì)的酰胺鍵存在幾種不同的振動(dòng)模式[37]，其中酰胺I帶是研究二級(jí)結(jié)構(gòu)最有用的帶，被指定為C=O拉伸振動(dòng)，由1600～1700 cm-1范圍內(nèi)的波 段 組 成，1600～1640 cm-1、1640～1650 cm-1、1650～1660 cm-1、1660～1700 cm-1分別屬于β折疊、無規(guī)則卷曲、α螺旋、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。計(jì)算出的酸漿豆腐中二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例如表2所示?？梢钥闯?，生豆?jié){中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要是以β折疊（32.47%）和β轉(zhuǎn)角（34.33%）為主，α螺旋和無規(guī)則卷曲含量相近，分別為16.66%、16.54%；與生豆?jié){相比，熟豆?jié){中除β折疊含量增加外，其他三種結(jié)構(gòu)都有不同程度的減少，這主要是由于加熱使得豆?jié){中蛋白質(zhì)變性，空間結(jié)構(gòu)展開，在氫鍵、疏水作用等化學(xué)鍵的作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的趨勢(shì)增大，即大豆蛋白的熱聚集行為[38]；添加酸漿制備成豆腐后，β折疊含量減少，無規(guī)則卷曲、α螺旋和β轉(zhuǎn)角增加，隨著酸漿添加量的增加，β折疊含量從33.84%增加到34.80%，無規(guī)則卷曲從16.04%下降到15.80%，α螺旋從16.00%下降到15.83%，β轉(zhuǎn)角從34.12%下降到33.57%，表明其他三種結(jié)構(gòu)逐漸向β折疊轉(zhuǎn)變，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變得有序，推測(cè)可能是由于H+的增加導(dǎo)致維持蛋白構(gòu)象的內(nèi)部作用力（如疏水作用）暴露，分子間作用力的增加使得蛋白質(zhì)快速聚集，有助于形成有序穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

表2 酸漿添加量對(duì)豆腐二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of physalis addition on secondary structure of tofu

綜上所述，在酸漿豆腐制備過程中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以β結(jié)構(gòu)為主，煮漿導(dǎo)致β折疊含量增加，其他結(jié)構(gòu)含量均減少；豆腐壓制成型后，β折疊含量有所減少，但隨著酸漿添加量的增加，β折疊含量不斷回升，無規(guī)則卷曲含量減少，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有序性提高。

3 結(jié)論

3.1 通過比較不同酸漿添加量制備的酸漿豆腐的凝膠特性發(fā)現(xiàn)：隨著酸漿添加量的增加，豆腐的質(zhì)構(gòu)性增強(qiáng)，硬度、彈性和咀嚼性均在26%時(shí)達(dá)到最大值；豆腐的保水性、含水量及得率均隨酸漿添加量的增加而降低，酸漿豆腐中的蛋白質(zhì)含量約占13%～16%，其中可溶性蛋白約占總蛋白的2%～4%，隨酸漿添加量的增加，豆腐中蛋白含量逐漸增加，可溶性蛋白逐漸減少；酸漿豆腐中的主要分子間作用力為疏水作用和二硫鍵，二者合計(jì)占比超過90%，離子鍵和氫鍵的貢獻(xiàn)率相對(duì)較低，其中疏水作用是7S蛋白參與凝膠的主要作用力，11S蛋白的部分A亞基通過離子鍵和氫鍵參與凝膠形成，大分子蛋白聚集體、11S蛋白的B亞基和A3亞基主要通過二硫鍵參與凝膠的形成；酸漿添加量為20%和23%時(shí)，豆腐凝膠具有相對(duì)細(xì)膩的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加量為26%時(shí)，豆腐凝膠空隙增大且粗糙；β結(jié)構(gòu)是維持酸漿豆腐中蛋白質(zhì)構(gòu)象的主要結(jié)構(gòu)，隨著酸漿添加量的增加，α螺旋含量從16.00%減少到15.83%，無規(guī)則卷曲從16.04%減少到15.80%，β轉(zhuǎn)角從34.12%減少到33.57%，β折疊從33.84%增加到34.8%。3.2 目前我國(guó)各地酸漿豆腐的生產(chǎn)條件和酸漿品質(zhì)存在很大差異，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，需要根據(jù)豆腐生產(chǎn)的具體要求以及酸漿性質(zhì)來選擇合適的酸漿添加量。統(tǒng)一酸漿豆腐的工藝條件及豆腐品質(zhì)和酸漿添加量的量化工作仍需進(jìn)一步的研究。