趙諶董，龐俊倩，趙鑫丹，郝苑汝，翟梅枝,2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100）（2.陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

隨著食品工業(yè)發(fā)展，天然抗氧化劑作為有效防止油脂氧化酸敗的重要手段被人們所重視。植物中富含抗氧化活性成分，是天然抗氧化劑的主要來源。植物內(nèi)生真菌是指部分或全部生活史存活于健康植物組織內(nèi)部，但不會(huì)引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀，并能產(chǎn)生與宿主植物體中相同或相似化合物的真菌[1]。胡蘿卜苷作為抗氧化活性物質(zhì)，具有消炎、抗腫瘤等作用。姚麗娜等[2]從杜仲葉片中分離提取出槲皮素、咖啡酸和胡蘿卜苷等抗氧化活性物質(zhì)。吳聰慧等[3]從杜仲葉片分離出一株內(nèi)生真菌Alternariasp.，從其發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物中檢測(cè)出甘露醇、胡蘿卜苷等抗氧化活性物質(zhì)，與葉片中含有相同成分。植物內(nèi)生真菌不僅可生產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)，而且其代謝產(chǎn)物生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和地域影響。因此植物內(nèi)生真菌已成為人們獲取天然抗氧化物質(zhì)的重要來源，具有開發(fā)成新型食品抗氧化劑的潛力[4]。

核桃（Juglans regiaL.），胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Juglans）落葉喬木，其青皮、殼、仁、葉等部位廣泛應(yīng)用于制藥與食品方面[5]，被稱為世界“四大干果”之一。核桃作為高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值食品，其抗氧化能力受到較多關(guān)注。核桃葉、青皮、分心木和內(nèi)種皮等不僅具有較強(qiáng)的清除自由基能力，其不同部位還富含多酚和黃酮類抗氧化活性物質(zhì)。Ivo等[6]通過DPPH自由基清除能力測(cè)定核桃青皮水提物的半抑制濃度（Half-inhibitory concentration，IC50）均低于1 mg/mL，趙鑫丹等[7]研究表明，核桃內(nèi)種皮提取物對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力IC50分別為0.009 mg/mL和0.021 mg/mL，表明核桃青皮、內(nèi)種皮提取物有較好的自由基清除能力，具有較好的抗氧化能力。Pereira等[8]發(fā)現(xiàn)核桃葉片中含有槲皮素3-半乳糖苷、綠原酸和香豆酸等抗氧化活性物質(zhì)，景援朝等[9]從核桃分心木乙醇提取物中分離得到胡桃苷、沒食子酸、兒茶素和胡蘿卜苷等抗氧化活性物質(zhì)，表明核桃的葉片和分心木中富含多種抗氧化活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化能力。因此充分利用核桃資源，在開發(fā)天然抗氧化劑方面有著非常廣闊的前景。

近年來，隨著核桃研究的深入，從其中發(fā)現(xiàn)了豐富的內(nèi)生真菌。Wang等[10]從核桃的根、枝、葉、果實(shí)四個(gè)部位分離得到64株核桃內(nèi)生真菌，鑒定后歸為17屬，其中交鏈孢霉屬（Alternaria）為優(yōu)勢(shì)類群?；萁ǔ萚11]從核桃的不同組織部位分離得到643株內(nèi)生真菌，鑒定后歸為30屬，其中交鏈孢霉屬（Alternaria）為優(yōu)勢(shì)類群，占菌株總數(shù)的27.06%；莖葉核菌屬（Ectostroma）和花核菌屬（Anthina）為亞優(yōu)勢(shì)類群，分別占菌株總數(shù)的12.13%和8.09%。核桃內(nèi)生真菌的多樣性為研究核桃內(nèi)生真菌抗氧化活性提供依據(jù)，龐俊倩等[12]前期研究表明，核桃內(nèi)生真菌LTS-6-6菌株代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基有較好清除能力，初篩為高活性抗氧化菌株，表明核桃內(nèi)生真菌是尋找天然抗氧化劑的良好資源。本研究以高活性菌株LTS-6-6為研究對(duì)象，研究其代謝產(chǎn)物各萃取物的抗氧化活性及對(duì)菜（籽）油的氧化穩(wěn)定性的影響，為核桃內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物作為油脂抗氧劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃內(nèi)生真菌交鏈孢霉屬（Alternaria）LTS-6-6，自藍(lán)田核桃幼果青皮中分離，由西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。

市售菜（籽）油。

1.2 試劑及儀器

蘆丁、沒食子酸、維生素C，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；水楊酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司；亞硝酸鈉，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；三氯化鐵，洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀，廣東光華科技股份有限公司；硫代硫酸銨，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（TPTZ），上海源葉生物制藥有限公司；TBHQ，阿拉丁生化試劑有限公司。

UV-1200紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SKY-2102C恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；XMTD-8222電熱鼓風(fēng)燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同極性萃取物制備

取菌株LTS-6-6于PDA培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)4～6 d后，接種至PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液經(jīng)過濾后依次用等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三種溶劑分別進(jìn)行多次萃取，各萃取液濃縮至浸膏狀后，分別得到石油醚萃取物（Petroleum ether extract，PEE）、乙酸乙酯萃取物（Ethyl acetate extract，EAE）、正丁醇萃取物（Butyl alcohol extract，BAE）及萃余物（Water extract，WTE），根據(jù)旋蒸后萃取物重量將各濃縮萃取物配成10 mg/mL的溶液，備用。

1.3.2 抗氧化活性測(cè)定

1.3.2.1 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參照白海娜等[13]的方法。室溫黑暗中將7 mmol/L ABTS原液與2.45 mmol/L過硫酸鉀按2:1比例混合反應(yīng)12～16 h得ABTS自由基儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液與過硫酸鉀混合搖勻，獲得ABTS自由基溶液，加入到濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1 mg/mL的樣品中測(cè)定吸光度，對(duì)照為Vc，每組試驗(yàn)平行操作測(cè)定3次，取平均值。按下式計(jì)算ABTS自由基清除率，通過線性方程計(jì)算IC50。

ABTS自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：

A——30 ℃下反應(yīng)6 min樣品溶液后于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度；

A0——用4 mL無水乙醇代替ABTS自由基溶液的吸光度值；

A1——用1 mL蒸餾水代替樣品的吸光度值。

1.3.2.2 羥基自由基的清除能力的測(cè)定

采用水楊酸法，參照Z(yǔ)hao等[14]的方法。將1 mL濃度為6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和1 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液混合后，加入1 mL 1 mg/mL樣品溶液和1 mL 0.1% H2O2溶液，對(duì)照為Vc，每組實(shí)驗(yàn)平行操作測(cè)定3次，取平均值，按下式計(jì)算羥基自由基清除率，通過線性方程計(jì)算IC50。

羥基自由基清除率的計(jì)算公式為：

式中：

A——加入樣品溶液后的吸光度值；

A0——未加雙氧水的吸光度值；

A1——未加試樣的吸光度值。

1.3.2.3 總還原力

采用FRAP法，參照Léon W Nitiema等[15]的方法。將10 mmol/L TPTZ溶液與20 mmol/L三氯化鐵溶液等體積混合后，加入10倍體積0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH=3.6），得到FRAP溶液。以Vc標(biāo)品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)?；貧w方程為：Y=66.341X-0.0005，R2=0.9998。

1.3.3 總酚和總黃酮含量測(cè)定

1.3.3.1 總酚含量

采用福林酚法，參照FranciscVasile D等[16]的方法。向福林酚試劑中加入樣品后，加入1.4 mol/L碳酸鈉溶液，常溫避光下水浴反應(yīng)2 h，波長(zhǎng)760 nm下測(cè)定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/g）為橫坐標(biāo)，760 nm處吸光度為縱坐標(biāo)?；貧w方程為：

1.3.3.2 總黃酮含量采用鋁鹽顯色法，參照張新國(guó)等[17]的方法。將亞硝酸鈉溶液和硝酸鋁溶液混合后，加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，以60%乙醇定容。波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/g）為橫坐標(biāo)，510 nm處吸光度為縱坐標(biāo)?；貧w方程為：Y=1.0046X+0.0005，R2=0.9998。

1.3.4 EAE對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性影響

1.3.4.1 過氧化值和酸值測(cè)定

采用Schaal烘箱法加速油脂氧化酸敗，過氧化值測(cè)定根據(jù)GB/T 5009.227-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測(cè)定》方法，計(jì)算公式如下：

式中：

POV——樣品的過氧化值，mmol/kg；

V——樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；

V0——空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；

C——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；

m——樣品質(zhì)量，g；

1000——換算系數(shù)。

酸值測(cè)定根據(jù)GB/T 5009.229-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價(jià)的測(cè)定》方法，計(jì)算公式如下：

式中：

X——樣品的酸值（以KOH計(jì)），mg/g；

V——樣品消耗KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；

V0——空白樣消耗KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；

C——KOH標(biāo)準(zhǔn)滴定的實(shí)際濃度，mol/L；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.4.2 貨架期預(yù)測(cè)

參考Kim等[18]的方法，采用Schaal烘箱法，進(jìn)行加速氧化試驗(yàn)。將樣品于70 ℃烘箱中密封儲(chǔ)存，測(cè)定8 d內(nèi)每24 h的過氧化值和酸值。根據(jù)阿倫尼烏斯經(jīng)驗(yàn)公式，反應(yīng)溫度每升高10 ℃，反應(yīng)速度提高1倍[19]，如公式所示：但反應(yīng)速率常數(shù)（K）與油脂貨架期(Q)呈反相關(guān)，即反應(yīng)速率常數(shù)（K）越大，油脂酸敗氧化速度越快，油脂的貨架期越短，如公式所示：儲(chǔ)藏溫度與油脂貨架期的關(guān)系見表1所示。

表1 溫度與貨架期系數(shù)的關(guān)系Table 1 Relationship between temperature and shelf life coefficient

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018軟件繪圖，所有試驗(yàn)設(shè)置3組平行，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析法和皮爾遜相關(guān)系數(shù)法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LTS-6-6發(fā)酵產(chǎn)物不同極性萃取物的體外抗氧化活性

2.1.1 不同極性萃取物對(duì)ABTS自由基的清除效果

由圖1可以看出，在供試濃度范圍內(nèi)5種處理組均可不同程度地清除ABTS自由基。當(dāng)供試濃度為0.001 mg/mL時(shí)，PEE、BAE的ABTS自由基清除率與WTE、EAE的ABTS自由基清除率均有顯著差異（p＜0.05）。在0.005～0.03 mg/mL內(nèi)，相同濃度下，處理間的ABTS自由基清除率均有顯著差異（p＜0.05）；濃度為0.04 mg/mL、0.1 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率在4種萃取物處理間均有顯著差異（p＜0.05），清除率分別依次為：EAE（98.05%、99.65%）＞BAE（41.21%、86.21%）＞W(wǎng)TE（19.28%、34.41%）＞PEE（17.25%、28.42%），且都顯示EAE與Vc的ABTS自由基清除率無顯著差異（p＞0.05）；濃度為0.05 mg/mL時(shí)，PEE、WTE兩處理間的ABTS自由基清除率無顯著差異（p＞0.05），二者與其余處理均有顯著差異（p＜0.05）。

由圖1還可以看出，在0.001～0.04 mg/mL內(nèi)，不同濃度EAE的ABTS自由基清除率均有顯著差異（p＜0.05）；4種萃取物中，EAE的ABTS自由基清除能力優(yōu)于其余萃取物。當(dāng)濃度為0.03 mg/mL時(shí)，EAE與Vc的ABTS自由基清除率有顯著差異（p＜0.05），二者清除率分別為96.82%和99.10%。在0.04～0.1 mg/mL濃度內(nèi)，不同濃度EAE的ABTS自由基清除率無顯著差異（p＞0.05），且ABTS自由基清除率在相同濃度EAE與兩處理間無顯著差異（p＞0.05）。各處理的IC50依次為：Vc（9 μg/mL）＜EAE（13 μg/mL）＜BAE（41 μg/mL）＜WTE（106 μg/mL）＜PEE（131 μg/mL）。

綜上可見，EAE具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力。

2.1.2 不同極性萃取物對(duì)羥基自由基的清除效果

由圖2可以看出，在供試濃度范圍內(nèi)5種處理均可不同程度地清除羥基自由基，PEE、EAE在不同濃度處理間清除率均有顯著差異（p＜0.05），且EAE的羥基自由基清除能力優(yōu)于其余萃取物。在0.01～2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，各萃取物不同濃度之間的羥基自由基清除率均有顯著差異（p＜0.05）；當(dāng)BAE濃度為0.05和0.1 mg/mL時(shí)，其羥基自由基清除率無顯著差異（p＞0.05），分別為7.6%和8.0%；WTE的羥基自由基清除率在0.05 mg/mL與0.01 mg/mL、0.1 mg/mL濃度間無顯著差異（p＞0.05），0.01 mg/mL與0.1 mg/mL處理間羥基自由基清除率有顯著差異（p＜0.05）。

由圖2還可看出，在相同濃度下各處理均呈現(xiàn)隨著處理濃度的增大，對(duì)羥基自由基清除率也逐漸增大的趨勢(shì)。當(dāng)濃度≤0.05 mg/mL時(shí)，4種萃取物中BAE的羥基自由基清除率高于其余萃取物；在0.1～2 mg/mL時(shí)，相同濃度下的羥基自由基清除率依次為：EAE＞BAE＞PEE＞W(wǎng)TE。當(dāng)濃度≤0.5 mg/mL時(shí)，EAE處理的羥基自由基清除率均顯著高于Vc處理的清除率（p＜0.05），當(dāng)濃度≥1 mg/mL時(shí)，兩處理間無顯著差異（p＜0.05）。表明在此濃度范圍內(nèi)二者的羥基自由基清除能力接近，二者的羥基自由基清除率分別為86.17%和85.05%。EAE、Vc的IC50分別為0.832 mg/mL、0.976 mg/mL。在2.0 mg/mL時(shí)5個(gè)處理的羥基自由基清除率依次為：EAE（86.17%）＞Vc（85.05%）＞BAE（47.45%）＞PEE（36.23%）＞W(wǎng)TE（13.40%）。

綜上表明，EAE為高活性萃取物，可以有效清除羥基自由基。

2.1.3 不同極性萃取物的FRAP總還原力

FRAP通常用來表示樣品的還原能力，吸光度值越大其還原能力越強(qiáng)[20]。由圖3可以看出，隨著質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)后溶液的吸光度值也不斷增大。在0.005 mg/mL時(shí)，PEE、BAE處理組的吸光度值無顯著差異（p＞0.05），但兩者分別與WTE、EAE處理組的吸光度值有顯著差異（p＜0.05）。0.01 mg/mL時(shí)，PEE、BAE處理組的吸光度值之間無顯著差異（p＞0.05），PEE、BAE分別與WTE、EAE處理組的吸光度值有顯著差異（p＜0.05）。0.015 mg/mL時(shí)，WTE、PEE、BAE、EAE各處理間的吸光度值均有顯著差異（p＜0.05）。相同濃度各萃取物吸光度值依次為：EAE＞BAE＞PEE＞W(wǎng)TE。相同濃度下EAE的吸光度值均高于其余萃取物的吸光度值，說明EAE總還原力高于其余萃取物，具有較強(qiáng)抗氧化能力。這與潘峰等[21]研究結(jié)果一致。相同處理時(shí)，PEE、BAE、EAE在不同濃度間吸光度值均有顯著差異（p＜0.05）。濃度≤0.015 mg/mL時(shí)，不同濃度的WTE處理之間無顯著差異（p＞0.05），濃度≥0.015 mg/mL時(shí)，不同濃度的WTE處理之間均有顯著差異（p＜0.05）。

綜合分析認(rèn)為，EAE無論在ABTS自由基清除能力和羥基自由基清除能力，還是在FRAP總還原能力方面，均強(qiáng)于其余萃取物，說明EAE為高活性萃取物，具有開發(fā)成新型抗氧化劑的潛力。

2.2 抗氧化活性與總酚和總黃酮含量相關(guān)性分析

菌株LTS-6-6發(fā)酵產(chǎn)物的不同極性萃取物中總酚和總黃酮含量見圖4。

由圖4可以看出，就總酚含量而言，4種萃取物之間均存在顯著差異（p＜0.05），總酚含量依次為EAE（643.71 mg沒食子酸/g）＞PEE（183.42 mg沒食子酸/g）＞BAE（97.70 mg沒食子酸/g）＞W(wǎng)TE（36.55 mg沒食子酸/g），且EAE的總酚含量達(dá)到WTE的17.61倍。就總黃酮含量而言，EAE與其他3種萃取物之間差異顯著，總黃酮含量依次：EAE（102.05 mg蘆丁/g）＞PEE（34.33 mg蘆丁/g）＞BAE（13.58 mg蘆丁/g）＞W(wǎng)TE（12.11 mg蘆丁/g）。EAE總黃酮含量102.05 mg蘆丁/g，為WTE的8.43倍。由此可看出，不同萃取物中總酚和總黃酮含量的順序與ABTS自由基清除率、羥基自由基清除率和還原能力有所不同。PEE的總酚和總黃酮含量大于BAE，但自由基清除率和總還原能力則為BAE＞PEE。說明BAE中除多酚和黃酮類物質(zhì)之外，其他抗氧化活性物質(zhì)與之具有協(xié)同增效作用。

對(duì)抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，高活性菌株LTS-6-6代謝產(chǎn)物的體外抗氧化活性和酚類、黃酮類物質(zhì)呈正相關(guān)。其中ABTS自由基清除率與總酚含量顯著相關(guān)（p＜0.05），但與總黃酮含量相關(guān)性不顯著（p＞0.05）；羥基自由基清除率與總酚、總黃酮含量均有顯著相關(guān)性（p＜0.05）；總還原能力與總酚、總黃酮含量均具有極顯著相關(guān)性（p＜0.01）。綜上可見，高活性菌株LTS-6-6代謝產(chǎn)物的抗氧化活性與其總酚、總黃酮含量密切相關(guān)。

表2 總酚、總黃酮含量和抗氧化能力的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson’s correlation coefficient with total phenol content and total flavonoid from LTS-6-6 and antioxidant capacities

2.3 乙酸乙酯萃取物（EAE）對(duì)菜（籽）油氧化穩(wěn)定性的影響

2.3.1 添加抗氧化劑對(duì)菜（籽）油過氧化值的影響

在添加0.02% TBHQ、0.02% Vc、0.01%～0.05%EAE條件下，采用烘箱法（70 ℃）加速油脂氧化，供試菜（籽）油在試驗(yàn)期間的過氧化值見表3。

表3 不同處理組對(duì)菜（籽）油的過氧化值Table 3 Different treatment group on peroxide value of rapeseed oil

由表3可知，菜（籽）油處理1～6 d時(shí)，空白對(duì)照組（Control check，CK）的過氧化值與處理組均有顯著或極顯著差異，表明處理組可不同程度的抑制菜（籽）油氧化。處理3 d時(shí)，CK組的過氧化值9.32 mmol/kg，遠(yuǎn)大于6.0 mmol/kg（國(guó)標(biāo)閾值）；6 d時(shí)CK組的過氧化值遠(yuǎn)超閾值，達(dá)到24.77 mmol/kg，但添加0.01%～0.05% EAE處理組均未超過閾值。4～6 d時(shí)，添加0.01% EAE處理組與其余處理組的過氧化值均有顯著差異（p＜0.05）。比較添加0.02% EAE和0.02%Vc兩個(gè)處理組，在相同處理時(shí)間內(nèi)兩個(gè)處理間的油脂過氧化值均無顯著差異（p＞0.05），表明在此時(shí)間范圍內(nèi)，添加相同濃度的EAE和Vc二者的抑制菜（籽）油氧化能力相當(dāng)，添加0.05% EAE處理組的抗氧化效果與添加0.02% TBHQ處理組接近，在相同處理時(shí)間時(shí)，二者的過氧化值無顯著差異（p＞0.05）；6 d時(shí)其過氧化值分別為3.39 mmol/kg和3.41 mmol/kg，遠(yuǎn)低于臨界值，說明添加0.05% EAE能較好地抑制菜（籽）油的氧化作用?？颠B虎等[22]研究顯示，加入0.02%石榴籽多酚后其6 d時(shí)過氧化值為3.34 mmol/kg，本試驗(yàn)添加0.05% EAE后6 d時(shí)過氧化值為3.39 mmol/kg，兩者抗氧化效果接近。由此可看出，高活性菌株LTS-6-6發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物（EAE）在抗油脂氧化方面具有較好潛力。

2.3.2 添加抗氧化劑對(duì)菜（籽）油酸值的影響

在添加0.02% TBHQ、0.02% Vc、0.01%～0.05%EAE條件下，采用烘箱法（70 ℃）加速油脂酸敗，供試菜（籽）油在試驗(yàn)期間的酸值變化見表4。

表4 不同處理組對(duì)菜（籽）油酸值的影響Table 4 Effect of different treatment group on acid value of rapeseed oil

由表4可知，就不同處理時(shí)間而言，添加0.01%EAE時(shí)，處理第4 d除與2 d的油脂酸值無顯著差異外（p＞0.05），與其他處理時(shí)間的油脂酸值均有顯著差異（p＜0.05）；14 d時(shí)，添加0.01% EAE的處理組酸值為2.74 mg/g，添加0.02%～0.05% EAE的處理組酸值均小于為2 mg/g，表明添加EAE的各處理組均較好抑制油脂酸敗。添加0.03%～0.05% EAE時(shí)，處理第4 d與2 d及處理前的油脂酸值均無顯著差異（p＞0.05），與處理后第6～14 d的油脂酸值均有顯著差異（p＜0.05）。

菜（籽）油處理6～14 d時(shí)，相同處理時(shí)間的CK與其他處理間的油脂酸值均有顯著或極顯著差異，表明處理組均可不同程度地抑制菜（籽）油酸?。惶幚?0 d時(shí)，CK組油脂的酸值已超過3.0 mg/g（國(guó)標(biāo)閾值），其余處理組酸值均小于2 mg/g。8～14 d時(shí)，CK組與處理組的酸值均有極顯著差異（p＜0.01）。供試時(shí)間內(nèi)，添加0.02% EAE與0.03% EAE、Vc處理組的酸值無顯著差異（p＜0.05），表明添加0.02% EAE與二者抑制菜（籽）油酸敗效果相當(dāng)，14 d時(shí)三者的酸值分別為1.86 mg/g、1.79 mg/g和1.81 mg/g；添加0.05% EAE處理組的抗酸敗效果與添加0.02% TBHQ處理組接近，二者酸值無顯著差異（p＜0.05），14 d時(shí)酸值分別為1.43 mg/g和1.41 mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于臨界值，說明添加0.05% EAE較好的抑制菜（籽）油的酸敗作用。康連虎等[22]研究顯示，添加0.02%石榴籽多酚14 d時(shí)酸值為2.76 mg/g，與本研究添加0.01% EAE處理14 d的酸值2.72 mg/g接近，說明EAE具有較好的抗油脂酸敗作用。

綜上可知，在菜（籽）油過氧化值達(dá)到6 mmol/kg過程中，其酸值小于3 mg/g，表明菜（籽）油的氧化速率要高于酸敗速率。處理14 d內(nèi)，添加5種濃度EAE均對(duì)菜（籽）油酸敗氧化產(chǎn)生明顯抑制作用，說明EAE作為天然抗氧化劑，在抗油脂氧化酸敗方面具有較好潛力。

2.3.3 貨架期的預(yù)測(cè)

不同處理加速氧化在不同時(shí)間的過氧化值和酸值及對(duì)菜（籽）油貨架期預(yù)測(cè)見圖5和表5。

由圖5和表5可知，70 ℃加速氧化條件下，未添加抗氧化劑的菜（籽）油，在3 d時(shí)過氧化值超到國(guó)標(biāo)閾值，達(dá)到9.32 mmol/kg，貨架期相當(dāng)于在20 ℃下儲(chǔ)存64 d；在6 d時(shí)，添加0.01% EAE的菜（籽）油過氧化值達(dá)到5.78 mmol/kg；在8 d時(shí)，添加0.02%EAE的菜（籽）過氧化值達(dá)到5.88 mmol/kg；二者均小于國(guó)標(biāo)閾值。說明添加EAE抑制了菜（籽）油的氧化。由阿倫尼烏斯經(jīng)驗(yàn)公式推知，添加了0.01%或0.02% EAE的菜（籽）油在20 ℃下的貨架期分別192 d、256 d，較對(duì)照分別延長(zhǎng)了128 d、192 d。

表5 不同處理組菜（籽）油貨架期預(yù)測(cè)Table 5 Prediction of the shelf life of rapeseed oil in different treatment groups

綜上可見，添加LTS-6-6發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物（EAE），可降低菜（籽）油過氧化值和酸值，有效抑制油脂酸敗氧化。

3 結(jié)論

體外抗氧化活性測(cè)定顯示，核桃內(nèi)生真菌LTS-6-6代謝產(chǎn)物的4種萃取物中，EAE自由基清除率高于其余萃取物，EAE對(duì)ABTS、羥基自由基清除率達(dá)到80%以上，其IC50分別為13 μg/mL和0.832 mg/mL，與陽(yáng)性對(duì)照Vc相當(dāng)；EAE總酚和總黃酮含量高于其余萃取物，其含量分別為643.71 mg沒食子酸/g和102.05 mg蘆丁/g；采用Schaal烘箱法加速菜（籽）油酸敗氧化表明，不同濃度EAE均對(duì)菜（籽）油酸敗氧化具有一定抑制作用。由阿倫尼烏斯公式預(yù)測(cè)，添加0.02%EAE的菜（籽）油，20 ℃下貨架期可達(dá)256 d，較對(duì)照延長(zhǎng)了192 d。綜上認(rèn)為，菌株LTS-6-6代謝產(chǎn)物的高活性萃取物，在體外抗氧化和油脂加速氧化試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用，有望作為一種新型抗氧化劑進(jìn)一步研究與利用。