蘭靜，徐勁松，阮春花，夏國(guó)際

（江西省中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院，南昌 330000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種破壞性肺部疾病，患病率及致死率均處于較高水平，其已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。COPD進(jìn)入急性加重期可導(dǎo)致患者病情加重，肺功能隨之減弱，嚴(yán)重者甚至發(fā)生呼吸衰竭，危及生命[2]。因此，預(yù)防COPD急性加重期（acute exacerbation of COPD，AECOPD）發(fā)生是目前治療COPD的重要目標(biāo)。有報(bào)道表明，COPD氣道黏液高分泌可引發(fā)患者管腔狹窄，這種病理變化與1 s用力呼吸容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）及FEV1/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）具有相關(guān)性，其可貫穿于COPD始終，尤以急性發(fā)作期最為明顯[3-4]。血清中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）參與COPD氣道黏液高分泌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其可導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)受損并降解表面活性物質(zhì)，亦可在多途徑介導(dǎo)下誘導(dǎo)黏蛋白產(chǎn)生[5-6]。研究證實(shí)，NE在刺激黏液產(chǎn)生及分泌中發(fā)揮重要作用[1]。然而，目前關(guān)于血清NE與AECOPD肺功能的研究較少。為此，本研究通過(guò)建立AECOPD大鼠模型，探究血清NE與肺功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組40只Wistar大鼠購(gòu)于廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（閩）2018-0003，體重180～220 g，所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，溫度、濕度分別控制在22～24℃、50%～60%，均自由進(jìn)食及飲水，并予以每12 h晝夜更替。

隨機(jī)抽取20只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組，不作任何處理；余20只大鼠通過(guò)熏吸香煙及氣管內(nèi)注射內(nèi)毒素的方式建立COPD模型，建模成功后根據(jù)李建生等[7]AECOPD模型建立方法制備AECOPD模型，作為AECOPD組。

1.2材料與儀器 內(nèi)毒素（上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)）；哈德門(mén)香煙（上海卷煙廠(chǎng)生產(chǎn)）；金黃色葡萄球菌（北京安鑫康科技有限公司提供，菌號(hào)：ACTT25923）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（北京強(qiáng)欣博瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；大鼠NE試劑盒（安徽澤升科技有限公司公司生產(chǎn)）；小動(dòng)物肺功能儀（上海然哲儀器設(shè)備有限公司提供）；FLUOstar OPTIMA多功能酶標(biāo)儀（香港伯齊科技有限公司提供）。

1.3 AECOPD模型構(gòu)建 于實(shí)驗(yàn)1～28 d（7 d、14 d、28 d除外）將大鼠放入密閉的有機(jī)玻璃倉(cāng)，同時(shí)向玻璃倉(cāng)中注入5%哈德門(mén)香煙煙霧，1次/d，30 min/次；于7 d、14 d、28 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向大鼠氣管內(nèi)注入0.2 mL 1 mg/mL內(nèi)毒素建立COPD模型。COPD模型構(gòu)建成功后，于實(shí)驗(yàn)第29天向COPD大鼠模型鼻腔內(nèi)注入0.3 mL金黃色葡萄球菌，2次/d，連續(xù)注入3 d構(gòu)建AECOPD大鼠模型。

1.4蘇木精-伊紅（HE）染色觀(guān)察兩組大鼠肺組織病理形態(tài)變化 每組取5只大鼠斷頭處死，開(kāi)胸后分離肺臟，然后采用5 mL 4%多聚甲醛固定大鼠兩側(cè)肺臟，48 h后將右肺取出經(jīng)常規(guī)脫水、包埋后行切片處理，厚度約為5μm，經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化。

1.5大鼠體重的測(cè)定 分別于建模后0周、4周、8周、12周進(jìn)行稱(chēng)重，分析兩組大鼠體重變化。

1.6 ELISA法檢測(cè)兩組大鼠血清NE水平 每組取15只大鼠，采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)下腔靜脈取血5 mL，然后置于離心機(jī)中以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清NE水平，嚴(yán)格按照NE試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，并采用多功能酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)處對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè)，所得吸光度值按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算NE水平。

1.7肺功能檢測(cè) 兩組大鼠均于下腔靜脈取血完成后采用小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）、最大通氣量（maximal voluntary ventilation，MVV）、0.3 s用力呼吸容積（FEV0.3）/FVC及呼氣峰流速（peak expiratory fowl rate，PEF）。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析法分析AECOPD大鼠血清NE與肺功能指標(biāo)的關(guān)系，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)分析 正常對(duì)照組肺組織未見(jiàn)明顯變化，肺泡結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，氣管和支氣管黏膜纖毛完整無(wú)脫落，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；AECOPD組肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡壁變薄，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，周?chē)梢?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道黏膜上皮杯狀細(xì)胞增生，管壁纖維組織增生，支氣管上皮細(xì)胞壞死、脫落，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)分析（HE染色，×100）

2.2兩組大鼠體重比較AECOPD組大鼠體重增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組慢，且在8周、12周時(shí)AECOPD組大鼠體重低于正常對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠體重比較 g，

表1 兩組大鼠體重比較 g，

2.3兩組大鼠血清NE及肺功能指標(biāo)比較AECOPD組血清NE水平與Ri均較正常對(duì)照組升高，MVV、FEV0.3/FVC、PEF均較正常對(duì)照組降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠NE及肺功能指標(biāo)比較

表2 兩組大鼠NE及肺功能指標(biāo)比較

2.4 AECOPD大鼠血清NE與肺功能的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson分析，AECOPD大鼠血清NE與Ri呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.530，P=0.003），與MVV（r=-0.456，P=0.011）、FEV0.3/FVC（r=-0.395，P=0.031）、PEF（r=-0.554，P=0.002）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 AECOPD大鼠血清NE與肺功能的相關(guān)性分析

3 討論

AECOPD起病急驟，病情進(jìn)展迅速，患者通常表現(xiàn)為發(fā)熱、咳喘加劇、痰量增加、痰液黏度或顏色異常等，是導(dǎo)致COPD患者肺功能下降的重要因素[8-9]。AECOPD發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，臨床尚未發(fā)現(xiàn)可有效治療該疾病的藥物及方法，治療難度較大[10]；除此之外，AECOPD呈進(jìn)行性發(fā)展，隨著病情的加重，氣道阻力升高，可進(jìn)一步引發(fā)呼吸肌疲勞及氣體交換異常，加速肺功能下降，亦可導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓、肺心病等，嚴(yán)重威脅患者生命健康，給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11]。

合理的動(dòng)物模型作為探索疾病的橋梁及有效手段，對(duì)多種疾病臨床狀態(tài)的探究具有重要價(jià)值[12]。熏吸香煙及氣管內(nèi)注射內(nèi)毒素的方式建立COPD模型已經(jīng)得到臨床學(xué)者廣泛認(rèn)可[13]，故本研究通過(guò)該方式成功構(gòu)建COPD大鼠模型，且在此基礎(chǔ)上采用鼻腔內(nèi)注入金黃色葡萄球菌的方式構(gòu)建AECOPD模型發(fā)現(xiàn)，由病理學(xué)角度來(lái)看，正常大鼠未見(jiàn)明顯變化，AECOPD大鼠出現(xiàn)部分肺組織實(shí)變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，其肺組織病理學(xué)變化與人類(lèi)AECOPD病理表現(xiàn)相符，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。并且AECOPD組大鼠體重增長(zhǎng)速度較正常對(duì)照組慢，且在8周、12周時(shí)AECOPD組大鼠體重低于正常對(duì)照組，說(shuō)明AECOPD作為慢性消耗性疾病多存在營(yíng)養(yǎng)缺失，體重減少已成為該疾病常見(jiàn)表現(xiàn)。

氣道黏液可有效抵御外來(lái)有害物質(zhì)入侵，然而氣道黏液過(guò)度分泌可導(dǎo)致黏液潴留、黏液纖毛清除功能異常等，進(jìn)而導(dǎo)致氣道阻塞及反復(fù)感染[14]。中性粒細(xì)胞可在肺內(nèi)聚集并通過(guò)釋放多種促炎因子而引發(fā)NE大量分泌，并進(jìn)一步加重氣道阻塞[15]。中性粒細(xì)胞活化后可促進(jìn)NE分泌，而NE是一種破壞性極強(qiáng)的彈性蛋白酶，其可導(dǎo)致組織炎癥反應(yīng)，已被證實(shí)與COPD起病及進(jìn)展密不可分[16]。當(dāng)COPD進(jìn)入急性加重期，NE活性明顯上，這與中性粒細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)關(guān)系緊密[17]。目前已有報(bào)道表明，COPD患者氣道分泌物中主要是NE大量聚集，而NE可促進(jìn)AECOPD氣道黏液高分泌[18]。汪強(qiáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者血清NE、高遷移率族蛋白-1水平均較COPD穩(wěn)定期患者及健康老年人群顯著升高，說(shuō)明AECOPD患者體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)，且肺組織可能受到嚴(yán)重?fù)p傷；除此之外，穩(wěn)定期患者血清NE、高遷移率族蛋白-1水平亦較健康老年人群升高，說(shuō)明COPD患者處于穩(wěn)定期體內(nèi)亦出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，可繼續(xù)損傷肺組織；兩種因子持續(xù)作用可能是連續(xù)不斷地氣道炎癥及氣道重塑，是引發(fā)肺組織破壞的重要機(jī)制。肺功能指標(biāo)是臨床判斷AECOPD患者通氣障礙和氣流受限的重要方法，可為臨床判斷患者病情改善情況提供依據(jù)[20]。本研究結(jié)果顯示，AECOPD組血清NE水平與Ri均較正常對(duì)照組升高，MVV、FEV0.3/FVC、PEF均較正常對(duì)照組降低。這與李杰等[12]研究結(jié)果相一致，AECOPD大鼠血清NE水平升高，提示其體內(nèi)可能存在一定程度慢性炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)急性加重期氣道黏液高分泌，并導(dǎo)致肺組織破壞。經(jīng)Pearson分析，AECOPD大鼠血清NE與Ri呈正相關(guān)關(guān)系，與MVV、FEV0.3/FVC、PEF呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明NE可影響AECOPD肺功能，與肺功能進(jìn)行性下降密切相關(guān)，推測(cè)NE影響AECOPD肺功能的作用機(jī)制可能為：NE作為一種極強(qiáng)的促黏液分泌物質(zhì)，其可通過(guò)促進(jìn)氣道黏蛋白表達(dá)及黏液釋放而引發(fā)氣道炎癥時(shí)黏液高分泌狀態(tài)的產(chǎn)生，此時(shí)氣道內(nèi)黏液過(guò)度增加，氣道阻塞進(jìn)一步加重，可形成嚴(yán)重的氣流受限，最終導(dǎo)致AECOPD肺功能持續(xù)下降。

綜上，AECOPD血清NE水平升高與AECOPD肺功能持續(xù)下降密切相關(guān)。