李娜，陳曉藝△，黃小童，李清平

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，南寧 530023；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200）

壯瑤藥方蠲痹顆粒祛風(fēng)除濕、止痛，主治風(fēng)寒濕三氣合而成痹者。蠲痹顆粒處方出自清代程國(guó)彭《醫(yī)學(xué)心悟》蠲痹湯，因臨床用于防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，療效確切，獲批為國(guó)家古代經(jīng)典名方類新藥，醫(yī)學(xué)前景良好[1-2]。組方由羌活、獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎等組成。目前關(guān)于蠲痹顆粒制劑質(zhì)量控制方面少有研究，為使制劑質(zhì)量得到有效控制，本研究建立HPLC法測(cè)定蠲痹顆粒中綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸3種指標(biāo)性成分含量的方法，為蠲痹顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1主要儀器 美國(guó)Waters-e2695高效液相色譜儀（包括四元高壓泵系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器和柱溫箱等）；BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XS205電子天平（梅特勒-托利多）；超聲清洗器（SG250HE，上海冠特超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH-4，常州奧華儀器有限公司）；超純水用密思博超純水機(jī)制備。

1.2試藥 蠲痹顆粒樣品由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠自制（生產(chǎn)批號(hào)為20201201、20201202、20201203、20201204、20201205、20210101、20210102、20210103、20210104、20210105）。對(duì)照品：綠原酸（chlorogenic acid，B20782，含量98%），上海源葉生物科技有限公司；龍膽苦苷（gentiopicroside，供含量測(cè)定用，190513，含量98%）和阿魏酸（ferulic acid，供含量測(cè)定用，110773-201614，含量99%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司；甲酸（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇（分析純），西隴科學(xué)有限公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18（250 mm×4.6 mm,5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（5 min，5%A；5～20 min，5%～12% A；20～40 min，12%～20% A；50～65 min，20～90%A；65～80 min，90%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：龍膽苦苷277 nm，綠原酸、阿魏酸320 nm；流速為1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，分別制成濃度為0.984 9 mg/mL、0.991 76 mg/mL及1.002 87 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。另取上述溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋，制成含綠原酸、龍膽苦苷及阿魏酸濃度分別為0.295 5 mg/mL、1.487 6 mg/mL、0.200 6 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，置于冰箱貯存，備用。

2.3供試品溶液制備 取蠲痹顆粒約2 g，精密稱定，加入0.1%甲酸甲醇溶液定容至25 mL，超聲提取40 min，補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.22μm微孔濾膜，備用。

2.4陰性樣品溶液制備 按蠲痹顆粒的處方比例及制備工藝要求配制缺當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活；陰性樣品及缺秦艽陰性樣品，按照“2.3項(xiàng)”下方法制成相應(yīng)的陰性溶液。

2.5系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按“2.1項(xiàng)”下色譜條件分別測(cè)定對(duì)照品、供試品及陰性溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（320 nm）目標(biāo)物質(zhì)綠原酸、阿魏酸和（277 nm）目標(biāo)物質(zhì)龍膽苦苷分別在320 nm和277 nm相應(yīng)的對(duì)照品色譜與供試品色譜中相同的保留時(shí)間處都有色譜峰，并且分離度均大于1.5、理論塔板數(shù)均大于5 000，拖尾因子均在0.95～1.05。說(shuō)明該色譜條件適用于蠲痹顆粒中綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸這3個(gè)成分的測(cè)定，見圖1、圖2。

圖1 蠲痹顆粒HPLC色譜圖（277 nm）

圖2 蠲痹顆粒HPLC色譜圖（320 nm）

2.6線性范圍考察 取“2.2項(xiàng)”下制備的混合對(duì)照品溶液，配置成一系列濃度的對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，見表1。

表1 回歸方程及線性范圍

2.7精密度試驗(yàn) 取綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸混合對(duì)照品溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸的峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值分別為0.44%、0.20%、0.15%，和日間精密度的RSD值分別為0.25%、0.55%、0.71%，結(jié)果表明精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蠲痹顆粒（批號(hào)20201201）2.0 g，按“2.3項(xiàng)”下供試品溶液制備方法制備一份供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件依次測(cè)定綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸的峰面積，計(jì)算平均含量分別為0.358 3 mg/g、19.660 1 mg/g、2.265 0 mg/g，RSD值分別為0.11%、0.21%、0.19%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9重復(fù)性試驗(yàn) 取蠲痹顆粒（批號(hào)20201201）2.0 g 6份，精密稱定，按“2.3項(xiàng)”下方法制得供試品溶液6份，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，結(jié)果6份試樣中綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸平均含量分別：0.359 9 mg/g、19.320 5 mg/g、2.246 4 mg/g，RSD值分別為0.50%、0.65%、0.44%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10加樣回收率試驗(yàn) 取蠲痹顆粒（批號(hào)20201201）（綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸平均含量分別為0.359 9 mg/g、19.320 5 mg/g、2.246 4 mg/g）1.0 g，精密稱定6份，分別精密加入綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸對(duì)照品各0.295 0 mg、18.843 4 mg、2.005 7 mg。按“2.3項(xiàng)”下供試品溶液制備方法制備溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定各峰面積，計(jì)算綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸各加樣回收率分別為101.4%、97.2%、100.0%，RSD值分別為2.4%、2.7%、2.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好，見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)的結(jié)果 n=6

2.11樣品測(cè)定取10批蠲痹顆粒，各約2 g，精密稱定，按“2.3項(xiàng)”下制備方法制備供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，每批測(cè)定2次，計(jì)算綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸的含量，見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇“蠲痹湯”為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典名方，臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效確切，蠲痹顆粒根據(jù)國(guó)家藥品注冊(cè)法規(guī)要求將蠲痹湯開發(fā)成經(jīng)典名方類中藥新藥。組方由羌活、獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成。方中的藥材中均含有多種有機(jī)酸[3-5]、酚酸[6-7]及環(huán)烯醚萜苷[8]類成分，且環(huán)烯醚萜苷[9]和有機(jī)酸、酚酸[10]為其抗風(fēng)濕功效的有效成分。當(dāng)歸、羌活、桑枝、獨(dú)活均含有綠原酸，秦艽[11]含有龍膽苦苷，當(dāng)歸、獨(dú)活、川芎均含有阿魏酸，據(jù)文獻(xiàn)記載綠原酸[12]、龍膽苦苷[13]、阿魏酸[14]均有一定的抗炎、抗風(fēng)濕作用，為本品的主要活性成分。因此本研究選擇綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸作為質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2提取方法的選擇 以綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)提取方式（超聲提取法和回流提取法）、提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min）、溶劑用量（1∶10、1∶25、1∶50）、提取溶劑[磷酸-甲醇（1∶100）、甲酸-甲醇（1∶100）、水、甲醇、70%甲醇]方面進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，以25 mL甲酸-甲醇（1∶100）、超聲40 min所得供試品溶液中綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸3種成分總含量最高，且方法簡(jiǎn)單可行。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸的最大吸收波長(zhǎng)差異較大，在320 nm處，綠原酸、阿魏酸峰各項(xiàng)指標(biāo)較好，在277 nm處，龍膽苦苷峰各項(xiàng)指標(biāo)較好。為使各成分均能較好地檢出，故選擇320 nm為綠原酸、阿魏酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，277 nm為龍膽苦苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相組分選擇了以下幾組進(jìn)行考察：（1）甲醇-0.1%甲酸水溶液；（2）乙腈-0.1%甲酸水溶液；（3）乙腈-水；（4）甲醇-水。采用等度、梯度洗脫兩種洗脫方式進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示采用乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，可使各目標(biāo)成分達(dá)到較好分離，且峰形較好。

3.5柱溫考察 本研究分別考察了25℃、30℃、35℃3個(gè)柱溫下目標(biāo)物質(zhì)的分離效果，結(jié)果顯示，柱溫30℃時(shí)綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸3個(gè)成分的分離度及對(duì)稱因子均符合規(guī)定。

綜上所述，綠原酸、龍膽苦苷、阿魏酸3個(gè)成分含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均較好，方法簡(jiǎn)便，可更好地控制蠲痹顆粒內(nèi)在質(zhì)量，可作為本品的質(zhì)量控制的方法。