張庭鳳，蔡正文，孫蔚亮，梁 俐，甘廷慶，羅婕

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南寧 530007）

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡中起著重要的調(diào)控作用，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)。在乏氧微環(huán)境中，HIF-1和GLUT-1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)缺氧的適應(yīng)。國(guó)內(nèi)、外的相關(guān)研究顯示，HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1蛋白能夠作為惡性腫瘤的早期預(yù)警指標(biāo)以及腫瘤良、惡性的鑒別診斷指標(biāo)，而對(duì)三者在非霍奇金淋巴瘤中表達(dá)情況的研究報(bào)道較少。淋巴瘤國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）是非霍奇金淋巴瘤常用的預(yù)后判斷指標(biāo)，而HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表達(dá)與IPI的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在對(duì)HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)情況以及與IPI的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年3月至2021年3月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的非霍奇金淋巴瘤和淋巴結(jié)增生患者的病理切片標(biāo)本，均經(jīng)病理診斷證實(shí)。非霍奇金淋巴瘤42例（淋巴瘤組），其中男25例，女17例；年齡20～69歲，中位年齡45歲。淋巴結(jié)增生37例（淋巴結(jié)增生組），其中男20例，女17例；年齡18～62歲，中位年齡34歲。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表達(dá) 使用生物組織脫水機(jī)完成組織脫水、透明和浸蠟。組織包埋、4μm連續(xù)切片和烤片。常規(guī)切片脫蠟和抗原修復(fù)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次3 min。將配制好的3%過(guò)氧化氫滴加于切片組織上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次。滴加稀釋的山羊血清，室溫封閉30 min，以減少非特異性染色。滴加稀釋的一抗（HIF-1α 稀釋比1∶200、HIF-2α 稀釋比1∶400、GLUT-1稀釋比1∶500），于4°C冰箱中孵育過(guò)夜。PBS沖洗切片3次，每次3 min，滴加酶標(biāo)鏈霉親和素標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗（稀釋比1∶1 000），37℃孵育30 min。PBS沖洗后每張切片滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色，用蒸餾水沖洗切片終止顯色。用Harris蘇木素復(fù)染2 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用PBS浸洗返藍(lán)。然后將切片置于梯度乙醇中脫水，二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。晾干的切片在顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.2結(jié)果判讀 由兩位具有副主任醫(yī)師資格的病理學(xué)專家雙盲閱片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)估HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1表達(dá)情況。判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，11%～50%為1分，51%～79%為2分，≥80%為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分與染色強(qiáng)度得分相乘即為染色指數(shù)（staining index，SI），SI≥3視為陽(yáng)性。

1.2.3 IPI評(píng)分 按年齡、分期、結(jié)外病變、體力分級(jí)（ECOG評(píng)分）、乳酸脫氫酶（LDH）5個(gè)指標(biāo)（Shipp標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行IPI評(píng)分。本研究將IPI按0～2分（低危、低中危）和3～5分（高中危、高危）分為兩組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用列聯(lián)系數(shù)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、HIF-2α 及GLUT-1 蛋白在淋巴瘤和淋巴結(jié)增生中的表達(dá)

淋巴瘤組HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于淋巴結(jié)增生組（P＜0.01），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 淋巴瘤和淋巴結(jié)增生HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1免疫組化染色（SP法，×400）

表1 兩組HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 n（%）

2.2 淋巴瘤組織中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1表達(dá)之間的相關(guān)性分析

淋巴瘤組織中HIF-1α的表達(dá)與HIF-2α、GLUT-1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.593，P＜0.05；r=0.583，P＜0.05），HIF-2α 的表達(dá)與GLUT-1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.331，P＜0.05）。

2.3 淋巴瘤不同IPI分組中HIF-1α、HIF-2α 及GLUT-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較

IPI 3～5分組HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于IPI 0～2分組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 淋巴瘤不同IPI分組中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)比較 n（%）

2.4 淋巴瘤中HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1表達(dá)與IPI評(píng)分相關(guān)性分析

HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1的陽(yáng)性表達(dá)與IPI評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系（0＜r＜1，P＜0.05），HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1陽(yáng)性表達(dá)者IPI評(píng)分也較高，見(jiàn)表3。

表3 HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1的表達(dá)與IPI評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

缺氧是許多惡性腫瘤的共同特征，腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)主要由HIF-1介導(dǎo)，HIF-1由HIF-1α、HIF-2α亞基與HIF-1β亞基共同構(gòu)成，GLUT-1是HIF-1的靶基因，α亞基是HIF-1的氧調(diào)節(jié)亞基，β亞基是結(jié)構(gòu)性亞基。常氧狀態(tài)下，α 亞基通過(guò)泛素化途徑被降解；而在低氧條件下，HIF-1α、HIF-2α降解被抑制，引起這兩者聚集，并與β亞基組成異二聚體發(fā)生適形性變化，使HIF-1蛋白與其下游的低氧反應(yīng)元件發(fā)生作用，誘導(dǎo)腫瘤血管生成、改變細(xì)胞能量代謝方式等發(fā)揮低氧調(diào)節(jié)能力[1]。目前已有許多研究證實(shí)，HIF-1在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，并在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲方面起著重要作用[2-5]。在本研究中，淋巴瘤組HIF-1α、HIF-2α 陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于淋巴結(jié)增生組（P＜0.05），提示淋巴瘤中HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)可能參與淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的調(diào)控，并有助于良、惡性淋巴結(jié)病變的鑒別。盡管HIF-1α、HIF-2α 均參與缺氧的調(diào)節(jié)，但兩者擔(dān)任角色不同，HIF-1α主要調(diào)節(jié)缺氧早期及急性期的適應(yīng)性反應(yīng)，而腫瘤的長(zhǎng)期和慢性缺氧過(guò)程中主要由HIF-2α 介導(dǎo)，這說(shuō)明在不同的缺氧時(shí)期，參與調(diào)控腫瘤組織缺氧適應(yīng)的HIF分子不同。有研究顯示，缺氧急性期HIF-1α表達(dá)明顯增加，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α 濃度逐漸下降，而HIF-2α 表達(dá)水平逐漸升高[3]。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α與HIF-2α 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示兩者在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中可能具有協(xié)同作用，但明確兩者的動(dòng)態(tài)變化還需要開(kāi)展更多的臨床研究加以證實(shí)。

GLUT-1是分布在細(xì)胞膜上的一類跨膜蛋白，是介導(dǎo)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的載體，同時(shí)也是HIF-1的靶基因。多項(xiàng)文獻(xiàn)表明，惡性腫瘤如頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌組織中GLUT-1的表達(dá)高于正常組織[4-8]。本研究檢測(cè)結(jié)果也顯示，淋巴瘤組中GLUT-1表達(dá)率明顯高于淋巴結(jié)增生組，其原因可能是惡性腫瘤組織代謝旺盛，需要攝取更多的能量，糖酵解較正常細(xì)胞高。此外，本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α、HIF-2α與GLUT-1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，與馬宗麗等[9]研究結(jié)果一致，證實(shí)了兩者之間的協(xié)同作用。缺氧條件下，GLUT-1作為HIF-1的靶基因，被激活轉(zhuǎn)錄，促使糖酵解增加以適應(yīng)乏氧環(huán)境，HIF-1α可通過(guò)介導(dǎo)乏氧反應(yīng)基因的調(diào)控而上調(diào)GLUT-1的表達(dá)[9]。同時(shí)，也表明兩者共同參與惡性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程的調(diào)控。

研究表明，在許多實(shí)體瘤中，HIF-1α 高表達(dá)已被證明與預(yù)后較差、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加和死亡率升高相關(guān)[10-12]；也有一些研究顯示，GLUT-1是影響原發(fā)性中樞系統(tǒng)淋巴瘤無(wú)進(jìn)展生存期的不利預(yù)后因素[13]。IPI是由國(guó)際非霍奇金淋巴瘤預(yù)后因素協(xié)作組于1993年提出的一個(gè)淋巴瘤預(yù)后判斷模型，國(guó)內(nèi)、外已有研究就IPI的預(yù)后意義評(píng)價(jià)進(jìn)行補(bǔ)充和完善，以期納入更有效的指標(biāo)以便更全面地評(píng)估非霍奇金淋巴瘤患者的預(yù)后[14-16]。本研究結(jié)果顯示，IPI 3～5分組HIF-1α、HIF-2α及GLUT-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于0～2分組；且HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1的陽(yáng)性表達(dá)與IPI評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，表明HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1可能是非霍奇金淋巴瘤預(yù)后不良的高危因素。

綜上所述，HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1三者對(duì)淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有著重要的調(diào)控作用，檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α和GLUT-1有助于良、惡性淋巴結(jié)病變的鑒別。另外，HIF-1α、HIF-2α、GLUT-1與IPI評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，三者可能是非霍奇金淋巴瘤預(yù)后不良的高危因素，對(duì)非霍奇金淋巴瘤高危人群的篩查和評(píng)估有一定的臨床意義。三者可否作為非霍奇金淋巴瘤的預(yù)后生物指標(biāo)，還有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。