郭思彤，譚思濤，梁小玲，黃菊，劉麗敏△

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）是一種常見的炎性疾病，以高尿酸血癥和關(guān)節(jié)或/和組織內(nèi)尿酸鈉（MSU）結(jié)晶為特征[1]。隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致全球范圍內(nèi)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升[2]。目前痛風(fēng)并無治愈方法，臨床治療主要以緩解癥狀和預(yù)防復(fù)發(fā)為主，常用藥物有秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素、別嘌呤醇和苯溴馬隆等[3]。以上藥物雖在控制癥狀方面有效，但存在副作用較大且停藥后易復(fù)發(fā)等問題[4]。因此，迫切需要開發(fā)更有效、副作用更小的治療痛風(fēng)藥物。

我國(guó)中醫(yī)理論認(rèn)為痛風(fēng)是由濕熱內(nèi)蘊(yùn)、血阻氣機(jī)、氣滯血瘀所致。驅(qū)風(fēng)止痛散（QFZTS）由腎茶（Clerodendranthus spicatus）、車前草（Plantaginis Herba）、牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）、蒼術(shù)（Atractylodis Rhizoma）和菟絲子（Cuscuta chinensis）組成，在民間常用于痛風(fēng)的治療。方中以腎茶為君藥，功能清熱去濕，排石利尿；車前草利尿、除濕、清熱、涼血，牛膝生用活血通經(jīng)，熟用可補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝，菟絲子滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿，三者輔助君藥清熱祛濕、活血通經(jīng)，共為臣藥；蒼術(shù)可燥濕、化濁、止痛，用作佐藥。諸藥配伍應(yīng)用，共奏利水消腫、滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨、消腫止痛之功效，但其作用機(jī)制尚不明確[5-9]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析QFZTS治療AGA的藥物靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，并通過構(gòu)建大鼠AGA模型探討QFZTS對(duì)AGA的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 QFZTS活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索QFZTS相關(guān)的所有化學(xué)成分，根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)，選取口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為初篩參數(shù)，再將篩選后得到的化合物成分經(jīng)過Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）比對(duì)，檢索文獻(xiàn)補(bǔ)充已驗(yàn)證靶點(diǎn)，最終獲取QFZTS活性成分的基因靶點(diǎn)。

1.2 AGA潛在靶標(biāo)的獲取 分別以O(shè)MIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）挖掘AGA相關(guān)基因，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果進(jìn)行整合，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到AGA的相關(guān)靶點(diǎn)。將得到的疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集，獲取其二者的共同靶點(diǎn)基因，為QFZTS作用于AGA的潛在靶點(diǎn)。

1.3靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型[10]，設(shè)定生物物種為人類，最低相互作用閾值取最高“highest confidence（≥0.9）”，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過CytoScape3.7.1中的hubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析篩選度值最佳的前20個(gè)靶點(diǎn)，得到潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，并通過分析其參與的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其功能進(jìn)行描述。

1.4 QFZTS治療AGA的基因本體及通路富集分析 為了分析和獲得目的基因的主要功能和通路富集，采用Cytoscape軟件的ClueGO插件，對(duì)QFZTS治療AGA的靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的信號(hào)通路，分析QFZTS治療AGA的通路。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～220 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0002。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及處置嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行。

1.6藥物和試劑QFZTS（廣西壯藥方醫(yī)院，批號(hào)：20180908）；秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)公司，批準(zhǔn)號(hào)：H53021369）、MSU（Aladdin公司，批 號(hào)：20211113）。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（江萊生物）；RNAiso Plus、RNA逆轉(zhuǎn)錄及定量擴(kuò)增試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

1.7實(shí)驗(yàn)分組和造模將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、秋水仙堿組（6×10-4 g/kg）及QFZTS高、中、低劑量組（6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg），每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按照體重分別灌胃給予不同濃度的QFZTS、秋水仙堿和蒸餾水（模型組），1次/d，連續(xù)給藥7 d。給藥第4天，使用滅菌注射器將MSU混懸液（25 mg/mL）注入踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為標(biāo)準(zhǔn)，誘導(dǎo)AGA模型，空白組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水[11]。

1.8血清炎癥因子含量測(cè)定 造模72 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，離心，取上清。采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平。

1.9踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察10%福爾馬林溶液固定大鼠關(guān)節(jié)，EDTA脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化。

1.10 RT-qPCR法檢測(cè)炎性小體（NLRP3）、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá) 取踝關(guān)節(jié)周圍軟組織，提取總RNA，BCA法測(cè)定濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸31 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由由寶工公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列如下，IL-1β上游：5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游：5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’；Caspase-1上游：5’-GACCGAGTGGTTCCCTCAAG-3’，下游：5’-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3’；NLRP3上游：5’-GCTGTGTGAGGCACTCCAG-3’，下游：5’-GAAACAGCATTGATGGGTCA-3’；GAPDH上游：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量[12]。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QFZTS藥物靶點(diǎn) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選腎茶、車前草、牛膝、蒼術(shù)、菟絲子，潛在的活性化合物，結(jié)合化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，補(bǔ)充有效成分及其靶點(diǎn)，得到QFZTS有效成分45個(gè)及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)254個(gè)。

2.2 AGA疾病靶點(diǎn) 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Acute Gouty Arthritis”，設(shè)定相關(guān)性分?jǐn)?shù)＞3，并通過檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充獲得AGA疾病相關(guān)靶點(diǎn)192個(gè)。

2.3 QFZTS治療AGA的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及靶點(diǎn)篩選

通過將QFZTS藥物靶點(diǎn)與AGA疾病靶點(diǎn)交集信息（圖1A）導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定生物物種為人類，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生直接及間接作用的基因33個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相互關(guān)系247個(gè)，見圖1B。用Cytoscape軟件的hubba功能篩選PPI網(wǎng)絡(luò)得到QFZTS治療AGA相關(guān)度最高的前20個(gè)基因靶點(diǎn)，包括絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）、白介素-8（CXCL8）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、一氧化氮合酶2（NOS2）、IL-1β、NLRP3、胱天蛋白酶1（CASP1）、過氧化物酶體增殖激活受體-γ（PPARG）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、IL-6、纖溶酶原激活物抑制因子1（SERPINE1）、淀粉樣β 前體蛋白（APP）、TNF、血紅素加氧酶1（HMOX1）、核轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、TGF-β1、趨化因子2（CCL2），見圖1C。

圖1 QFZTS-AGA基因靶點(diǎn)匹配

2.4 KEGG通路分析 采用Cytoscape軟件的ClueGO插件對(duì)QFZTS治療AGA的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路分析，結(jié)果顯示：QFZTS治療AGA可影響腫瘤、炎癥免疫反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，具體與IL-17、糖基化終末期受體（AGE-RAGE）、TNF、核苷酸結(jié)合寡聚域受體（NOD）和核因子（NF）-κB等相關(guān)信號(hào)通路，見圖2A。對(duì)QFZTS治療AGA的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，并對(duì)結(jié)果可視化，見圖2B。

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路富集分析

2.5各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量升高；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量下降，QFZTS中劑量組IL-6、TNF-α 水平降低，QFZTS低劑量組IL-6含量降低，見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.6踝關(guān)節(jié)滑膜組織切片病理組織結(jié)果 空白組踝關(guān)節(jié)滑膜組織完整，上皮細(xì)胞排列緊密整齊，未見異常炎癥細(xì)胞；模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，滑膜中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；秋水仙堿組炎癥細(xì)胞和組織增生減少；QFZTS各劑量組滑膜增生情況均有不同程度的改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，軟骨侵蝕性損傷減輕，見圖3。

圖3 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化（HE，×200）

2.7各組踝關(guān)節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)比較 與空白組比較，模型組踝關(guān)節(jié)周圍軟組織NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)上調(diào)；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高、中劑量組NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)下調(diào)，見表2。

表2 各組踝關(guān)節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)比較 ，n=10

表2 各組踝關(guān)節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)比較 ，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被證明是探索中醫(yī)藥的有力工具，能提供對(duì)藥物作用和疾病復(fù)雜性的系統(tǒng)理解和藥理學(xué)模型，有助于剖析中草藥對(duì)特定疾病的作用[13]。本研究成功構(gòu)建了QFZTS與AGA的中藥復(fù)方靶點(diǎn)—疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過對(duì)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的映射，預(yù)測(cè)潛在機(jī)制通路富集，并在進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)中，驗(yàn)證了QFZTS藥理作用的預(yù)測(cè)通路。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、MMP9、NLRP3、CASP1、PTGS2、TGF-β1是頂部節(jié)點(diǎn)重要靶點(diǎn)，KGEE結(jié)果顯示，IL-17、AGERAGE、TNF、NOD樣受體和NF-κB等信號(hào)通路與QFZTS治療AGA潛在作用機(jī)制密切相關(guān)。以上結(jié)果從理論機(jī)制層面上證明QFZTS通過多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的方式發(fā)揮治療AGA的作用。

AGA是由關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸濃度過高形成MSU晶體而引起的。MSU晶體被組織中巨噬細(xì)胞識(shí)別，觸發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng)，誘發(fā)炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎癥，過度和不間斷的炎癥會(huì)損害健康組織，最終導(dǎo)致軟骨變性和關(guān)節(jié)損傷[14]。在這個(gè)過程中，大量炎癥因子和細(xì)胞內(nèi)容物的釋放被認(rèn)為是AGA發(fā)病的關(guān)鍵[15]。同時(shí)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可知，QFZTS治療AGA機(jī)制可能與IL-17、TNF和NOD等炎癥信號(hào)通路密切相關(guān)。此外，已有研究證實(shí)，MSU可通過一系列反應(yīng)促進(jìn)NLRP3炎性小體形成，NLRP3通過激活Caspase-1和IL-1β，激活NOD受體家族信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)痛風(fēng)炎癥[16]。綜合考慮現(xiàn)有研究所揭示NLRP3在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病發(fā)病中的重要性，本課題組認(rèn)為NOD樣受體信號(hào)通路中NLRP3、Caspase-1、IL-1β靶點(diǎn)可能是QFZTS在AGA治療中的關(guān)鍵。

NOD樣受體蛋白—NLRP3炎性小體可被多種病原體和危險(xiǎn)因子激活，其中MSU是常見的危險(xiǎn)因子之一[17]。激活的NLRP3通過ASC激活pro-Caspase-1，活化Caspase-1將pro-IL-1β 切割成IL-1β，而IL-1β是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如TNF-α、IL-6和IL-8的釋放[18]。本研究顯示，經(jīng)QFZTS治療后，MSU誘導(dǎo)的AGA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著下降；滑膜組織損傷較模型組減輕，滑膜增生受到抑制，炎癥反應(yīng)明顯減弱；NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)受到抑制。初步證實(shí)，QFZTS能有效緩解MSU引起的AGA，其可能通過干預(yù)NOD樣受體信號(hào)通路，下調(diào)NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，抑制炎癥反應(yīng)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

TGF-β1是由成熟巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子，主要通過阻礙內(nèi)皮細(xì)胞活化，降低白細(xì)胞黏附聚集，激活炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子釋放[19]。MSU晶體在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉積后，刺激TGF-β1過度分泌，從而激活TAK1，促進(jìn)MKK激酶激活P38MAPK磷酸化，活化的P38MAPK可誘導(dǎo)下游NF-κB信號(hào)通路的高表達(dá)，最終促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1等炎癥因子的活化，加重關(guān)節(jié)炎癥損傷[20]。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，NFκB信號(hào)通路為QFZTS和AGA共同信號(hào)通路，且關(guān)聯(lián)度高，QFZTS干預(yù)后的AGA大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平下降，提示TGF-β1/P38MAPK/NF-κB通路可能是QFZTS治療AGA的另一途徑，仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析了QFSTS治療AGA的作用機(jī)制，初步證實(shí)QFZTS可通過調(diào)節(jié)NOD樣受體信號(hào)通路，抑制NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達(dá)，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。