張靜，張 潔，莫 穎，張 蕾，孫明慧

（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科，烏魯木齊 830000）

糖尿病腎臟?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病患者最嚴(yán)重、最普遍的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者死亡，也是終末期腎病（ESRD）的主要促成因素[1]。DKD有多種形態(tài)改變，包括系膜細(xì)胞肥大和增殖、腎小管細(xì)胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、足細(xì)胞凋亡等[2]，其中腎小管細(xì)胞EMT是引起腎功能損害最常見(jiàn)的原因[3]。DKD的易感因素包括遺傳、代謝機(jī)制紊亂、高血糖、胰島素抵抗、血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等[4]。有研究表明，糖尿病患者存在“遺留效應(yīng)”，表觀遺傳因素在該效應(yīng)中起到重要作用[5-6]。

腺嘌呤第6位氮原子上發(fā)生的甲基化修飾（m6A）是真核生物mRNA中最常見(jiàn)的甲基化修飾[7]。類甲基化轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）是構(gòu)成m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的核心組分，負(fù)責(zé)催化RNA發(fā)生m6A修飾[8]。在2型糖尿病中，葡萄糖調(diào)節(jié)METTL3介導(dǎo)的m6A修飾，然而，METTL3在糖尿病相關(guān)疾病調(diào)控中的作用存在爭(zhēng)議[9]，METTL3與DKD發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系仍不清楚。METTL3還可以介導(dǎo)m6A修飾調(diào)控miRNA表達(dá)[10]。有研究表明，多種miRNA在DKD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[11]。其中miR-126參與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展，在DKD中的表達(dá)下調(diào)，但具體作用機(jī)制尚不清楚[12-13]。本研究旨在探討METTL3對(duì)高糖（HG）誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）和大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）增殖的影響及其作用機(jī)制，并闡明METTL3與miR-126的相互作用，為探索DKD新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 大鼠NRK-52E細(xì)胞和大鼠HBZY-1細(xì)胞均購(gòu)自武漢Procell公司。將NRK-52E細(xì)胞和HBZY-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10%胎牛血清（FBS）和1%青—鏈霉素DMEM培養(yǎng)基的離心管中，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，胰酶消化，傳代，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑FBS、青—鏈霉素、酚紅（Gibco，美國(guó)）；MTT試劑盒（BioFroxx，德國(guó)）；TIANScript RT Kit、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根，中國(guó)）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Solarbio，中國(guó)）；smad2抗體、METTL3抗體（Proteintech，中國(guó)）；GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG（Bioswamp，中國(guó)）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（Cusabio，中國(guó)）；RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit（Millipore，美國(guó)）。

1.3細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NRK-52E和HBZY-1細(xì)胞，按3×105個(gè)/孔接種于96孔板，分為對(duì)照組、高糖（HG）組、HG+siRNA陰性對(duì)照（siRNA-NC）組和HG+METTL3 siRNA組。采用LipofectamineTM 2000分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和si-METTL3，細(xì)胞于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后吸出轉(zhuǎn)染液換入正常培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，其他各組用含有35 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。METTL3的siRNA序列由擎科生物生物科技有限公司合成，序列如下：METTL3 siRNA1：5’-GUCUAUAGUCCUGAAUUATT-3’；METTL3 siRNA2：5’-GUUGAUUGAGGUAAAGCGATT-3’；METTL3 siRNA3：5’-GGAAUUGGGCAGAGAAU GUTT-3’。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HBZY-1和NRK-52E細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定568 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光值（OD）。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 用不含EDTA的0.25%胰酶消化處理細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次；1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700μL預(yù)冷的80%乙醇；4℃條件下固定4 h，1 500 r/min離心5min，預(yù)冷PBS洗滌2次；加入100μL RNase，37℃水浴30 min；加入400μL PI，4℃避光染色30 min；用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光。

1.6 RT-qPCR法檢測(cè)METTL3和miR-126表達(dá)

通過(guò)DNAMAN軟件設(shè)計(jì)METTL3、β-actin、miR-126、U6熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物，并由擎科公司合成。METTL3引物上游：5’-TAAGCCCAGCACAACGTCTA-3’，下游：5’-CAACTCCTGGGCAGCA AATT-3’；miR-126引物上游：5’-TGCGCTCGTACCGTGAGTAATA-3’，下 游：5’-CCAGTGCAGG GTCCGAGGTATT-3’；U6引物上游：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下 游：5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；β-actin引物上游：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下 游：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：上、下引物10 μmol/L各0.4μL，2×SYBR Select Master Mix 10μL，RNase-free水4.8μL，cDNA模板4μL，50×ROX Reference Dye 20.4μL，配制成20μL體系混合均勻。PCR反應(yīng)條件：在ABI（QuantStudio 6）儀器上保持95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，延展95℃，15 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算METTL3和miR-126相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blotting法檢測(cè)METTL3和smad2蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗smad（1∶3 000）、METTL3（1∶3 000）、GAPDH（1∶1 000）稀釋液4℃下孵育過(guò)夜；洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL顯色，在暗室中壓片、曝光、顯影，用Band Scan分析條帶灰度值。

1.8細(xì)胞上清液中TGF-β1含量檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TGF-β1含量，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.9 RNA免疫共沉淀技術(shù)（RIP）采用RIP實(shí)驗(yàn)探討miR-126和METTL3之間的結(jié)合情況。RIP分析使用Magna-RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒（Magna RIP Kit，Millipore）。測(cè)定抗體的總RNA（輸入對(duì)照）和同型對(duì)照（IgG）。RT-qPCR法檢測(cè)共沉淀RNA。提取細(xì)胞中總RNA，并使用Ribo-Zero磁性試劑盒（Illumina）去除核糖體RNA。用RNA裂解試劑（Ambion）對(duì)核糖核酸進(jìn)行裂解。使用之前在RIP免疫沉淀緩沖液中與磁性Dynabeads結(jié)合的抗m6A抗體（Synaptic Systems，202003）進(jìn)行RNA免疫沉淀，并與片段RNA孵育。經(jīng)蛋白酶K（10 mg/mL）處理后，用苯酚/氯仿/異戊醇提取RNA，用miR-126引物進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 METTL3 siRNA轉(zhuǎn)染效果及其對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E和HBZY-1細(xì)胞增殖的影響METTL3 siRNA1組、METTL3 siRNA2組、METTL3 siRNA3組METTL3 mRNA表達(dá)均下調(diào)，且siRNA1效果最佳，見(jiàn)圖1。因此選擇siRNA1作為后續(xù)轉(zhuǎn)染片段。NRK-52E和HBZY-1細(xì)胞中，HG+METTL3 siRNA組增殖活性均較HG組提高，且METTL3 siRNA對(duì)NRK-52E細(xì)胞的促增殖作用較明顯，見(jiàn)表1。因此選擇NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RT-qPCR法驗(yàn)證3條METTL3 siRNA轉(zhuǎn)染效果

表1 METTL3 siRNA對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E和HBZY-1細(xì)胞增殖的影響 ，n=3

表1 METTL3 siRNA對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E和HBZY-1細(xì)胞增殖的影響 ，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

2.2 METTL3 siRNA對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞周期的影響HG+METTL3 siRNA組G1期細(xì)胞所占百分比較HG組降低，而S期細(xì)胞所占百分比較HG組升高，HG+siRNA-NC組與HG組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組細(xì)胞周期比較

表2 METTL3 siRNA對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞周期的影響 ，n=3

表2 METTL3 siRNA對(duì)HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞周期的影響 ，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

2.3 METTL3 siRNA可抑制HG處理的NRK-52E細(xì)胞TGF-β1、smad2及miR-126表達(dá) 與對(duì)照組比較，HG組METTL3、smad2蛋白表達(dá)及TGF-β1水平升高；與HG組比較，HG+METTL3 siRNA組MET-TL3、smad2蛋白表達(dá)及TGF-β1水平降低；HG組與HG+siRNA-NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3、表3。

表3 METTL3 siRNA對(duì)NRK-52E細(xì)胞TGF-β1、METTL3、smad2及miR-126表達(dá)的影響 ，n=3

表3 METTL3 siRNA對(duì)NRK-52E細(xì)胞TGF-β1、METTL3、smad2及miR-126表達(dá)的影響 ，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

圖3 Western blotting蛋白電泳圖

2.4 METTL3與miR-126的相互作用RIP結(jié)果顯示：METTL3 siRNA可降低HG處理的NRK-52E細(xì)胞miR-126的成熟能力，見(jiàn)圖4。表明METTL3可通過(guò)結(jié)合miR-126發(fā)揮作用。

圖4 RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證METTL3與miR126的相互作用

3 討論

m6A修飾包括甲基化轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14等）、去甲基化轉(zhuǎn)移酶（FTO）和識(shí)別蛋白（YTH家族）[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中METTL3表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，而METTL3 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞METTL3表達(dá)水平下降。提示HG刺激可提高甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，同時(shí)說(shuō)明RNA甲基化可能調(diào)控DKD發(fā)病機(jī)制。本研究中，HG誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性顯著降低，通過(guò)siRNA抑制METTL3表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性明顯升高。細(xì)胞周期中G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，G2為DNA合成后期。本研究結(jié)果顯示，METTL3 siRNA使得G1期細(xì)胞減少，S期和G2期細(xì)胞增加，表明沉默METTL3可促進(jìn)HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞DNA復(fù)制，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞分裂，這與細(xì)胞增殖率升高的結(jié)果相一致。

在DKD的病理生理過(guò)程中，腎纖維化是一個(gè)終點(diǎn)事件，主要特征為ECM蛋白的過(guò)度表達(dá)[15]。腎小管上皮細(xì)胞是DKD纖維化的主要來(lái)源，可以通過(guò)TGF-β1來(lái)調(diào)控[16]。而TGF-β1是DKD纖維化的重要生長(zhǎng)因子之一，能引起細(xì)胞凋亡、肥大、表型轉(zhuǎn)換、ECM積累等[17]。TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路主要為T(mén)GF1/smad信號(hào)通路，該通路的激活誘導(dǎo)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。本研究表明，TGF-β1、smad2在HG組中的表達(dá)量顯著升高，而這種表達(dá)變化可以被METTL3 siRNA抑制。提示METTL3 siRNA可能通過(guò)阻斷TGF1/smad2信號(hào)通路抑制HG誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞纖維化。

miRNA可被METTL3以m6A修飾依賴的方式調(diào)控，METTL3可影響miRNA的成熟，METTL3表達(dá)升高會(huì)增加miRNA含量，從而激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HG環(huán)境下細(xì)胞miR-126的表達(dá)量升高，METTL3 siRNA明顯降低miR-126的表達(dá)量。為了進(jìn)一步揭示METTL3與miR-126之間的相關(guān)性，本研究采用RIP實(shí)驗(yàn)，針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體將相互作用的miR-126和METTL3蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，經(jīng)過(guò)分離純化對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的miR-126進(jìn)行分析，結(jié)果表明METTL3可以特異性靶向miR-126并影響其表達(dá)。

綜上所述，METTL3在HG誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞增殖，其可能的作用機(jī)制為METTL3甲基化修飾miR-126，激活TGF-β1/smad2信號(hào)通路。本研究為DKD的機(jī)制研究提供了新的方向。