周 安 江煜靈

(1.東莞市公安局厚街分局，廣東 東莞523960；2.東莞市公安局，廣東 東莞 523000）

近年來，隨著DNA 提取技術(shù)的不斷進(jìn)步，骨骼DNA 檢驗(yàn)方法也得到迅速的發(fā)展，檢驗(yàn)效率以及檢出成功率不斷提高。對于高度腐敗尸體、白骨化尸體能夠成功檢出骨骼STR分型是尋找尸源的可靠手段之一，但是一些陳舊白骨化的骨骼類案件中，由于骨骼經(jīng)過風(fēng)吹雨打、長期暴曬或者濕潤等惡劣環(huán)境，污染極其嚴(yán)重，DNA 高度降解，增加了種屬鑒定和DNA 檢驗(yàn)的難度，成為法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定領(lǐng)域中的一大難題。本文通過對1例白骨化無名尸體中骨骼的成功檢驗(yàn)，探討了脫鈣結(jié)合磁珠法提取陳舊骨骼DNA的檢驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 檢材來源

2019年3月某日，報警人報警稱，其在廣東省東莞市某鎮(zhèn)路邊發(fā)現(xiàn)一個白色化肥編織袋，袋內(nèi)裝有一副殘缺的疑似人體的骸骨，后于2019年3月某日送檢2根疑似人體股骨和2020 年4 月某日送檢2 根疑似人體肱骨，要求做DNA檢驗(yàn)。

1.2 檢材的預(yù)處理

仔細(xì)觀察送檢的股骨和肱骨，發(fā)現(xiàn)均已白骨化，沒有軟組織附著，外表有少量污垢。遂取股骨和肱骨各2 根，股骨編為A、B 號，肱骨編為C、D 號。使用手術(shù)刀片刮清洗骨骼表面污物和骨腔表面層，放置在84 消毒液浸泡10min 后，純水多次沖洗干凈，切取寬約6mm骨密質(zhì)薄片2片，薄片放置于無水乙醇浸泡10min，將骨薄片剪成塊狀，濾紙擦干晾干備用。

1.3 DNA提取

采用螯合劑0.5mol/L EDTA（PH=8.0）溶液浸泡骨塊4h脫鈣，取各骨塊分別置于Freez?erMill 冷凍研磨儀，在液氮低溫環(huán)境下研磨至粉末狀，每份3g 骨粉放入10mL 的離心管內(nèi)，按骨骼專用磁珠法DNA 提取試劑盒（長春博坤公司）添加對應(yīng)比例的蛋白酶K 和骨粉孵育液?；靹蚝笾糜?6℃水浴恒溫12h，骨粉期間搖勻，補(bǔ)加一次蛋白酶K 225μL，繼續(xù)56℃水浴恒溫12h。離心取上清溶液，加入吸附液和超順磁性磁珠，充分搖勻后，吸取底部沉淀磁珠到提取試劑條，使用FL 案件專用型DNA 提取試劑盒（長春博坤公司，Kingfisher提取儀專用）提取骨粉模板DNA，洗脫體積30μL并收集。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳

使用Verifiler Plus 復(fù)合擴(kuò)增試劑盒（ABI公司，美國）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系10μL，其中 DNA 模板溶液 2μL，PCR 反應(yīng)混合液 8μL（含有 Master mix additive 的 Master Mix 2μL，Primer Mix 1μL，純水5μL），擴(kuò)增在ABI Veriti 96 well thermal cycler 上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI-3500XL 遺傳分析儀電泳后，使用Gen?eMarker V1.90軟件進(jìn)行分型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

股骨所得STR 分型結(jié)果（見圖1、圖2），肱骨所得STR 分型結(jié)果（見圖3、圖4），均能成功檢測有效分型。

圖1 白骨化股骨A檢出的STR分型圖譜

圖2 白骨化股骨B檢出的STR分型圖譜

圖3 白骨化肱骨C檢出的STR分型圖譜

圖4 白骨化肱骨D檢出的STR分型圖譜

由上述圖譜可見，所送檢材骨骼獲得的STR 電泳圖譜清晰，24 個基因座（圖為女性，缺少Yindel）均能顯示出峰，各基因座等位基因的峰高和分布均衡性較好，符合GA/T 1163—2014 的標(biāo)準(zhǔn)要求，但由于檢材降解因素，大片段基因座的峰值較低。

3 討論

3.1 檢材選取

本案送檢的骨骼已經(jīng)成白骨化，時間經(jīng)歷較久，但整副骨骼較為完整，沒有遭受嚴(yán)重破壞。選取股骨和肱骨進(jìn)行DNA 檢驗(yàn)，因?yàn)檫@兩個部位骨骼DNA 含量相對較多，DNA檢出率較高［1］。

3.2 污染控制

本案骨骼在白色化肥編織袋里發(fā)現(xiàn)，初步判斷是人為放置骨骼入編織袋內(nèi)，骨骼表面相對干凈，但無法排除是否有外源性DNA附著在內(nèi)，同時白骨化骨骼為疑難檢材，DNA 含量較低，因此檢驗(yàn)過程的污染控制十分重要，需做好以下幾點(diǎn)：首先，需做好檢驗(yàn)鑒定人員的保護(hù)以及檢驗(yàn)工具的清潔與消毒，保證檢材在檢驗(yàn)過程中不受污染；其次，在骨骼檢驗(yàn)前，必須對其進(jìn)行充分的去污處理，排除外源性DNA 的污染干擾；再次，由于該案無比對樣品，同一骨塊檢材要分開檢驗(yàn)，至少要獨(dú)立檢驗(yàn)二次，若是男性個體，至少應(yīng)做常STR 和Y-STR 多態(tài)性檢驗(yàn)，若是女性個體應(yīng)做常STR 和mtDNA（條件允許下）多態(tài)性檢驗(yàn)，確保能夠發(fā)現(xiàn)污染，及時排除干擾峰，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可溯源。

3.3 檢驗(yàn)方法

在骨骼處理過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）脫鈣環(huán)節(jié)，人體骨組織的細(xì)胞間質(zhì)主要由膠原質(zhì)和羥基磷灰石構(gòu)成，加入EDTA 使羥基磷灰石的鈣離子斷裂，有利于骨骼結(jié)構(gòu)疏松，易于裂解。由于預(yù)處理刮除骨骼表層組織，采用先脫鈣后研磨的思路，本案脫鈣時間嘗試在較短的時間中完成，避免了骨骼長時間脫鈣后DNA 含量嚴(yán)重?fù)p失的問題［2］，保留脫鈣液待復(fù)檢核對，骨骼的分型圖譜結(jié)果顯示均獲得較完整的STR 分型。（2）研磨環(huán)節(jié)，本案的骨骼使用液氮低溫研磨機(jī)進(jìn)行研磨處理，使檢材一直處于低溫保護(hù)中，保證研磨過程中檢材DNA 不會發(fā)生降解或變性，同時樣品一直處于在液氮研磨槽中，避免在外界交叉污染的風(fēng)險［3］。（3）磁珠轉(zhuǎn)移，在磁珠與骨粉裂解溶液下，吸取磁珠轉(zhuǎn)移到試劑條［4］進(jìn)行DNA 提取，磁珠能充分吸附骨粉的DNA，有效提高DNA 的產(chǎn)量，達(dá)到檢驗(yàn)高成功率。磁珠轉(zhuǎn)移法可以避免DNA 的污染和損失，該法操作相比其他提取方法［5-6］簡單方便，不易污染。

綜上所述，本文采用骨骼專用磁珠法DNA 提取試劑盒法結(jié)合Verifiler Plus 復(fù)合擴(kuò)增試劑盒檢驗(yàn)骨骼DNA，收集磁珠后一步轉(zhuǎn)移即可，檢驗(yàn)時間得到縮短，效率得到進(jìn)一步提高，具有操作簡單便利，試劑經(jīng)濟(jì)安全，DNA 產(chǎn)量高，能夠快速獲得完整的DNA 分型等特點(diǎn)，能滿足實(shí)際常規(guī)檢驗(yàn)的要求，此方法適合于基層法醫(yī)對陳舊骨骼的DNA 進(jìn)行檢驗(yàn)。