付海英 吳國忠

（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)，2019 年和2020 年我國的癌癥新發(fā)病例為393 萬和456 萬例［1］，這表明每天有超過1 萬人確診為癌癥，除了常規(guī)的手術(shù)及化學(xué)治療，約70%的患者接受放射治療。這是由于放療適應(yīng)范圍性廣、治療簡便，約有40%的實體腫瘤可以用放療根治［2］，因此放射治療逐步成為治療惡性腫瘤的主要手段之一。但是放射治療是利用α、β、γ射線和各類X射線治療機或加速器產(chǎn)生的X射線、電子線、質(zhì)子束及其他粒子束對腫瘤進(jìn)行局部治療?；颊咴诜派渲委煏r，臨床上根據(jù)不同腫瘤的放射敏感性，確定患者接受放療時的總劑量，如淋巴類腫瘤、腎母細(xì)胞瘤患者放療的劑量為20～40 Gy，而大多數(shù)鱗癌、腦瘤患者的劑量約為60 Gy，單次放射性治療的劑量為1～4 Gy［3‐4］。另外，利用X射線、超聲和核素的γ射線等對病理變化進(jìn)行判斷的放射診斷已在醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，如CT具有密度分辨率高、可連續(xù)掃描等優(yōu)點而被患者接受，但一次胸部CT，患者接受輻射當(dāng)量劑量約2 mSv。不同組織器官和細(xì)胞對輻射表現(xiàn)出不同的敏感性，從而產(chǎn)生不同的輻射生物學(xué)效應(yīng)。放射治療或診斷時除了患病部位，正常的組織器官也會或多或少受到電離輻射照射，引起不同程度的副作用，影響患者的治療效果和生活質(zhì)量［5］。

輻射損傷的主要危害是對造血及血液系統(tǒng)的損傷［3］。機體受到輻射損傷后，對骨髓細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，造成細(xì)胞內(nèi)生物大分子的劇烈分解，從而使某些造血細(xì)胞產(chǎn)生壞死，結(jié)果會降低骨髓的造血功能，出現(xiàn)造血系統(tǒng)的功能下降，同時也對血液系統(tǒng)的功能產(chǎn)生損害，使得如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、以及血小板等的數(shù)量出現(xiàn)不同程度的減少，最終導(dǎo)致各種并發(fā)癥，如出血、感染、貧血等，對人體造成比較嚴(yán)重的損害。輻射損傷也會對機體免疫系統(tǒng)有損傷作用，出現(xiàn)免疫力低下現(xiàn)象。同時輻射損傷會產(chǎn)生過量的自由基，導(dǎo)致人體的生物防御系統(tǒng)遭受破壞。輻射防護(hù)劑首先在體外實驗中被發(fā)現(xiàn)［3］，近幾十年的發(fā)展，已經(jīng)從最初的氨巰基類和色氨酸類防護(hù)劑，發(fā)展到毒性小的黃酮、多糖類合成藥和天然中草藥［6‐7］。前者可在機體受照射前短時間內(nèi)給藥有效，照射后給藥無效，其毒副作用較大、有效時間短、有效劑量窄、口服效果不好。近年來，美國［5，8］、韓國［9‐10］、印度［11‐12］和中國［13‐15］等國家的科研工作者在此領(lǐng)域開展了大量研究，從人工合成氨磷汀、超氧化物歧化酶類藥物逐漸過渡到從可食資源中提取維生素、黃酮類天然提取物。

天然草本提取物存在廣泛，容易獲取，且具有較強的抗氧化生物活性，又沒有明顯的毒副作用，近年來已逐漸成為各國研究篩選天然抗輻射防 護(hù) 劑 的 熱 點［5，16］。研 究 表 明：黃 芪［17‐18］、當(dāng)歸［4，19］、肉蓯蓉［20‐21］、白芍［22］等草本提取物含有的黃酮、苯乙醇苷、多糖等活性成分具有較強的抗氧化功效，能有效防護(hù)電離輻射造成的造血系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)損傷。由于單一組分天然提取物的水溶性差，單一使用時用量大。日本Aizawa等［23］利用蘆丁、橙皮素、柚皮素等多種物質(zhì)制備了復(fù)合防護(hù)劑，與單一組分相比，復(fù)合防護(hù)劑能更好地清除體內(nèi)氧化性自由基，并修復(fù)X 射線照射后的造血功能。韓國Kim等［22］開發(fā)了白芍、川芎、當(dāng)歸等提取物作為輻射防護(hù)劑，研究了對小鼠經(jīng)單次輻射3 Gy 或多次輻射7 Gy 后的喂養(yǎng)情況，系統(tǒng)比較了小鼠的免疫功能、造血機能變化，獲得了一種能促進(jìn)抗癌，提高免疫力和造血功能，保護(hù)機體免于氧化損傷的草本復(fù)合物，基于該專利的產(chǎn)品，Hemo Him已商業(yè)化，為腫瘤患者放射性治療時輔助使用。

本實驗研究C57BL/6 成年小鼠在受到輻射損傷（一次性全身照射4 Gy）后，利用黃芪、當(dāng)歸、肉蓯蓉、槐米、白芍等提取物制備草本組方進(jìn)行灌胃干預(yù)，同時以市場上購買的Hemo Him產(chǎn)品作為對照組（Hemo‐1#）進(jìn)行對比，比較不同配方草本組方對小鼠造血功能的修復(fù)，評價其防輻射功效，為進(jìn)一步研發(fā)天然輻射防護(hù)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

60Co γ 射線輻射源，中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，劑量率0.067 Gy/min；全自動動物血液細(xì)胞分析儀，BC‐2800Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；電子天平，ML503/02，梅特勒‐托利多儀器（上海）有限公司，精度1 mg；真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 材料

草本提取物均由陜西省某科技發(fā)展有限公司提供。黃芪提取物，棕褐色粉末；槐米提取物，黃色粉末，含曲克蘆丁98%；阿拉善肉蓯蓉提取物，黑色純粉；當(dāng)歸提取物，黃褐色粉末；白芍提取物，黃褐色粉末。

1.3 藥品配制

粉末樣品用自封袋密封后，經(jīng)60Co γ射線照射4 kGy滅菌后，樣品保存于真空干燥箱內(nèi)。草本組方的制備：經(jīng)照射后的各提取物分別加入一定量的去離子水，于50°C的熱水浴中超聲震蕩2 h，過濾除去不溶物。按等比例配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為12%的混合物樣品Exp‐2#和Exp‐3#，其中Exp‐2#為當(dāng)歸、白芍、肉蓯蓉、槐米的草本混合物；Exp‐3#為當(dāng)歸、白芍、肉蓯蓉、槐米、黃芪的草本混合物。對照組Hemo‐1#直接使用商業(yè)產(chǎn)品Hemo Him。

2 動物

小鼠品系：C57BL/6，周齡：6～8 周，性別：雌雄各半，體重：（20±2）g，來源：菲諾克生物科技（上海）有限公司。實驗環(huán)境溫度為（22±2）°C，相對濕度為（50±10）%。動物實驗在菲諾克生物科技（上海）有限公司完成。

2.1 分組與處理

56只成年小鼠，隨機分為4組，每組雌雄性小鼠各7 只：照射空白組（Blank）、1 組市售產(chǎn)品對照組（Hemo‐1#）、2組不同配方實驗組（Exp‐2#和Exp‐3#）。除照射空白組的小鼠給予200 μL的蒸餾水灌胃處理外，其余三組照射前3 d開始給藥，每天灌胃劑量均為200 μL，照射當(dāng)天不給藥；照射后，繼續(xù)給藥21 d。連續(xù)喂養(yǎng)3 d 后，4 組小鼠用60Co γ 射線全身一次性照射，吸收劑量率0.067 Gy/min，總吸收劑量4 Gy。

2.2 小鼠體重的變化

觀察指標(biāo)。（1）整體狀況：每天密切觀察各組小鼠的外觀皮毛、活動情況、攝食變化、體型及精神狀態(tài)變化。（2）體質(zhì)量：每只小鼠每天灌胃前稱量并記錄體重，以各組平均體重為縱坐標(biāo)，稱重天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制體重變化曲線，觀察灌胃給藥對小鼠體重的影響。

2.3 外周血象分析

小鼠照射后第1 天，于灌胃后1 h，眼球采血30 μL左右，吸入肝素抗凝管，采用自動血球分析儀測外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，各組分別于照射后第4、7、14 和21 天再測全血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）和淋巴細(xì)胞（Lymph）計數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS（Version 17.0）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（means±SD）表示，組間差異采用t檢驗。以顯著性差異p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 體重變化

照射前3 d 開始對Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#組小鼠給藥，觀察到小鼠出現(xiàn)軟便，體重為（23.3±0.8）g，保持不變，活動正常。照射后第4天，小鼠軟便消失，說明小鼠對草本混取物適應(yīng)性為7 d左右。

γ射線照射后小鼠體重變化曲線見圖1。由圖1可知，受照射后小鼠的體重均下降，Exp‐3#組小鼠體重變化最為明顯，到第4天體重下降到最低，約降低10%。實驗過程中，Hemo‐1#組小鼠體重變化趨勢與Blank組最為接近，變化幅度小，體重增長比較平穩(wěn)，而兩個配方Exp‐2#和Exp‐3#組的小鼠體重變化均起伏較大。照射后第14天，4組小鼠的體重均趨于穩(wěn)定。實驗中喂養(yǎng)草本組方對小鼠體重的促進(jìn)效果并不明顯，可能與小鼠對藥物的適應(yīng)性有關(guān)。

圖1 草本組方對照射小鼠體重變化Fig.1 Changes of the body weight after γ‐ray irradiation

3.2 白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)

白細(xì)胞作為機體免疫調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)細(xì)胞，對輻射有極高的敏感性，極易受到輻射的影響而發(fā)生DNA 的斷裂，細(xì)胞形態(tài)和功能以及細(xì)胞數(shù)量改變，因而白細(xì)胞計數(shù)已被用來作為輻射損傷程度的評估指標(biāo)。

未受到照射的正常8周齡C57BL/6小鼠的白細(xì)胞計數(shù)為（4.8±0.6）×109L-1，而照射空白組照射后第1 天，外周血白細(xì)胞計數(shù)為（1.0±0.1）×109L-1，表明照射后小鼠白細(xì)胞數(shù)量急劇下降，約為正常小鼠白細(xì)胞數(shù)量的20.8%。給藥的3 組小鼠白細(xì)胞數(shù)量較正常小鼠也下降，但均高于照射空白組。照射后第4 天，Hemo‐1#組的白細(xì)胞數(shù)量平穩(wěn)上升，而實驗的兩組Exp‐2#和Exp‐3#起伏較大。

圖2（b）中淋巴細(xì)胞與白細(xì)胞趨勢一致，小鼠經(jīng)4 Gy 照射后第1 天，外周淋巴細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，數(shù)量急劇下降。給藥的Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#組淋巴細(xì)胞數(shù)量有所降低，但均高于Blank組。而照射后第4天，兩實驗組無論白細(xì)胞還是淋巴細(xì)胞計數(shù)都出現(xiàn)急劇下降，推測小鼠對草本組方存在4～7 d的適應(yīng)性。到第7天，均逐步恢復(fù)。

圖2 草本組方對照射小鼠白細(xì)胞計數(shù)(a)和淋巴細(xì)胞計數(shù)(b)的影響Fig.2 Effects of herb formulas on the leukocyte counts(a)and lymph counts(b)for mice irradiated

3.3 血小板計數(shù)

血小板在止血和凝血過程中起重要作用，當(dāng)血管受損傷或破裂時，血小板受刺激，由靜止相變?yōu)闄C能相，迅即發(fā)生變形，表面黏度增大，凝聚成團；同時，在表面第Ⅲ因子的作用下，使血漿內(nèi)的凝血酶原變?yōu)槟?，后者又催化纖維蛋白原變成絲狀的纖維蛋白，與血細(xì)胞共同形成凝血塊止血，血小板顆粒物的釋放則進(jìn)一步促進(jìn)止血和凝血。

血小板壽命為10 d 左右，未受到輻射損傷的成熟巨核細(xì)胞可生成血小板。圖3顯示外周血中血小板在照后緩慢下降，照射后第7天最為明顯，但均在正常范圍，此后逐步恢復(fù)。

圖3 草本組方對照射小鼠血小板計數(shù)的影響Fig.3 Effects of herb formulas on the PLT counts for mice irradiated

3.4 紅細(xì)胞及血紅蛋白含量

動物造血系統(tǒng)對電離輻射極為敏感，一定劑量射線作用后，可引起外周血象及各類血細(xì)胞不同程度的變化。一般認(rèn)為，射線對成熟血細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)不大，但可導(dǎo)致幼稚造血細(xì)胞數(shù)量急劇減少，增殖功能明顯下降，結(jié)果外周血中成熟血細(xì)胞來源匱乏，加上死亡加速，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少。事實上，造血系統(tǒng)的損傷是輻射對機體最直接、最典型的生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)。

成熟紅細(xì)胞的壽命是120 d，每天以1%的速度更新，所以照射后早期紅細(xì)胞和血紅蛋白的變化不大，隨后逐漸減少；照射處理后第4天小鼠外周血的血紅蛋白顯著減少，且持續(xù)在較低的含量。

照射后第1 天及照射后第14 天，血紅蛋白的含量出現(xiàn)異常（圖4（b）），超出小鼠血紅蛋白正常范圍110～143 g/L，可能是因為全身照射4 Gy 的劑量對小鼠的心肺等臟器造成較嚴(yán)重的損傷。

圖4 草本組方對照射小鼠紅細(xì)胞(a)和血紅蛋白(b)含量的影響Fig.4 Effects of herb formulas on the RBC(a)and HGB(b)level for irradiated mice

進(jìn)一步比較γ射線照射后，利用草本組方持續(xù)喂養(yǎng)21 d，小鼠體重及血象指標(biāo)如表1所示?？梢钥闯?，照射后第1天，小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計數(shù)和血紅蛋白含量的下降說明電離輻射引起了小鼠造血機能損傷，給藥對照組Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#可不同程度減緩照射小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的下降幅度。持續(xù)喂養(yǎng)21 d后，4 組小鼠血象指標(biāo)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計數(shù)和血紅蛋白含量均趨于正常。同時研究過程中也觀察到血紅蛋白含量超出正常范圍，推測4 Gy 的劑量導(dǎo)致小鼠臟器部分受損，一次劑量對小鼠損傷的影響有待進(jìn)一步研究。

表1 草本組方對照射后小鼠血常規(guī)指標(biāo)Table 1 Changes of conventional indicators of peripheral blood after γ-ray irradiation (n=14）

4 結(jié)論

本研究采用黃芪、當(dāng)歸、白芍、肉蓯蓉等天然提取物配置草本組方，應(yīng)用于γ射線全身照射的小鼠，觀察其對照射前后小鼠體重、血象的影響，結(jié)果表明：4 Gy γ射線照射成年小鼠，導(dǎo)致小鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白含量的下降，說明電離輻射引起了小鼠造血機能的損傷，給藥后逐步恢復(fù)：照射后第7 天，白細(xì)胞、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞恢復(fù)正常。兩給藥組與市售產(chǎn)品Hemo‐1#比較，對小鼠體重影響、血象指標(biāo)的恢復(fù)基本相當(dāng)，但與Blank 組相比，差異均不顯著。實驗配方組Exp‐2#與Exp‐3#相比，照射后小鼠體重穩(wěn)定增長，Exp‐3#組出現(xiàn)波動起伏大，Exp‐2#組血象指標(biāo)數(shù)值也略優(yōu)于Exp‐3#組。綜合考慮，該草本組方含有多種提取物，其活性成分多，具有一定的輻射保護(hù)效果。但本研究僅選擇韓國商業(yè)產(chǎn)品Hemo Him作對比，獲得了相近的結(jié)果，后續(xù)需在組方活性成分、吸收劑量、受照射后骨髓干細(xì)胞、DNA 氧化性損傷等方面開展更為系統(tǒng)的研究，為多方位評價草本組方的應(yīng)用提供依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)說明 付海英是本研究工作的實驗執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)采集與分析，論文初稿的寫作，參與實驗設(shè)計和結(jié)果分析；吳國忠是項目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實驗設(shè)計、論文寫作與修改。二位作者都閱讀并同意最終的文本。