趙子麒，李一華，黃康庭，李 輝，唐亞斌，祝玲月，唐 健，石媛媛，林海能，王亞瓊，陳利軍，盧 勝，吳立潮

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.水土保持與荒漠化防治湖南省高等學(xué)校重點實驗室；b.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南長沙 410004；2.國有大桂山林場，廣西 賀州 542899；3.廣西地源之本肥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530001；4.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；5.廣西華沃特生態(tài)肥業(yè)股份有限公司，廣西 南寧 530022）

近20年來，桉樹作為我國3 大速生樹種之一，在中國種植面積超過546 萬hm2，以占我國2.5%的森林總面積生產(chǎn)超過全國總產(chǎn)量1/3 的木材。但是因為桉樹的單一樹種多代種植和短輪伐期的高強度經(jīng)營方式，使得林地更新頻繁，同時，桉樹林地經(jīng)營者仍使用傳統(tǒng)的煉山整地[1]，此方法對土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的巨大且長期的擾動，已引起社會廣泛關(guān)注[2]，那么該如何對舊有方法進行改進？目前，保留采伐剩余物的方法被認為是減輕林地更新對土壤生態(tài)環(huán)境擾動的主要可行方法之一。但是保留采伐剩余物的免煉山管理模式對土壤生態(tài)環(huán)境的影響又該如何評估？土壤微生物因為對土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與平衡、有機殘留物的分解[3-6]的重要作用，被認為是對土壤生態(tài)環(huán)境研究的關(guān)鍵部分。此外，土壤細菌群落組成也隨季節(jié)變化[7-12]，所以在不同季節(jié)下，土壤微生物群落又會產(chǎn)生何種動態(tài)變化？因此，對保留采伐剩余物的林地更新方式下的不同季節(jié)中的土壤微生物進行研究，對于解答本研究的疑問進而對桉樹人工林可持續(xù)發(fā)展規(guī)劃具有重要現(xiàn)實意義。

我國桉樹人工林現(xiàn)行的純林多代連栽模式被研究發(fā)現(xiàn)存在導(dǎo)致桉樹人工林土壤各項化學(xué)指標(biāo)、微生物生物量和酶活性下降的問題[13]。而多代種植之后，往往使用煉山即焚燒采伐剩余物的方法進行林地更新[14]。但煉山不僅會導(dǎo)致土壤養(yǎng)分的可利用性下降[15-16]，如研究發(fā)現(xiàn)煉山會平均造成桉樹人工林土壤N、P、K、Ca、Mg 的501.6、10.5、26.8、21.7、21.5 kg/hm2的損失[17]，進而會導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的劇烈擾動，這不僅是因為煉山導(dǎo)致的地上生物多樣性以及土壤微型和中型動物的喪失[18]，也和煉山導(dǎo)致的可能的化學(xué)元素的損失有關(guān)。比如氮被認為是不僅是植物生長的關(guān)鍵因素，陸地氮循環(huán)有關(guān)的關(guān)鍵過程由還原酶和氧化酶催化，其中微生物起主要作用，因此它的變化被認為也可以改變土壤微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性[19-21]。植物的根系不僅會和土壤化學(xué)性質(zhì)互相影響，其根系分泌物也會影響土壤微生物群落[22]。因此可以說，土壤微生物可以作為擾動引起土壤質(zhì)量變化的早期指標(biāo)[23]。而相關(guān)的在桉樹人工林土壤的研究也證明多代連栽和煉山均會導(dǎo)致細菌群落產(chǎn)生變化[13-24]，因此，了解土壤微生物性質(zhì)對不同林地更新模式的響應(yīng)，有助于更好地維持保留剩余物管理措施下人工林土壤的健康，保證土壤的產(chǎn)出的可持續(xù)性[25]。

采取保留采伐剩余物的處理方式時被認為是緩解桉樹人工林地力退化問題的有效措施[26]。采伐剩余物是森林采伐之后，不適宜加工為經(jīng)濟材、薪炭材和小規(guī)格材的所有廢棄物[27]。不同采伐剩余物管理措施對土壤的擾動和改變，很大程度上體現(xiàn)在對土壤輸入的有機殘留物[28]，如研究認為在桉樹人工林地進行免煉山，所有養(yǎng)分回歸土壤后，相當(dāng)于在1 hm2林地中施放33 t 腐殖質(zhì)、582 kg 的大量元素復(fù)合肥料[17]。且已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在杉木人工林地中皆伐后相比于煉山帶狀整地的土壤容重更低、孔隙度更高和改善化學(xué)性質(zhì)更快[29-30]。同時保留采伐剩余物也會對土壤細菌群落產(chǎn)生顯著影響[31]，如研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)分析后，尾葉桉人工林煉山的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征的平均度和圖形密度低于保留采伐剩余物[32]。此外，季節(jié)變化對土壤微生物也會產(chǎn)生影響[7-12]，如Lacerda-Júnior 等在對巴西干旱森林土壤的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤中放線菌和藍藻在旱季顯著富集，而變形桿菌、酸性細菌和類桿菌在雨季顯著增加[33]。因此，季節(jié)也是在研究保留采伐剩余物不同處理方式時應(yīng)考慮的影響因素之一。然而，現(xiàn)有關(guān)于不同采伐剩余物處理措施下在不同季節(jié)中對土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能所造成的影響尚未得到評估和深入探究。

綜上所述，本研究選取了在第3 代桉樹人工林林地基礎(chǔ)上重新營造的第一代尾巨桉桉樹人工林，在調(diào)查不同處理土壤化學(xué)性質(zhì)變化基礎(chǔ)上，評價了3 種不同采伐剩余物處理方式（移除、平鋪、堆放）下土壤樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)及潛在功能變化。因此本研究提出如下假設(shè)：1）不同采伐剩余物處理方式會對土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物群落產(chǎn)生影響并產(chǎn)生差異性；2）在造林之后的一年中，不同采伐剩余物處理的土壤的化學(xué)性質(zhì)會因為季節(jié)的變化而產(chǎn)生差異性變化；3）在保留采伐剩余物的處理方式下土壤肥力會隨著時間而上升，土壤中的細菌群落會受到林地更新的影響而激活，并且會隨著季節(jié)變化出現(xiàn)能量的釋放使用和儲存維持的現(xiàn)象。

為驗證這些假設(shè)，本研究的主要目標(biāo)是1）評價桉樹人工林不同采伐剩余物處理方式對表層土壤化學(xué)性質(zhì)細菌基因豐度的影響；2）評價不同采伐剩余物處理方式下營造的桉樹人工林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌群相對豐度及潛在功能；3）并研究各處理土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，尋找顯著影響土壤細菌多樣性的環(huán)境因子。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)賀州市國有大桂山林場（111°20′05″～111°54′39″E，23°58′33″～24°14′25″N）。該地屬濕潤亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫19.3℃，極端最高溫39.7℃，極端最低溫-2.4℃，年積溫6 243℃；年平均降水量2 056 mm，年蒸發(fā)1 275 mm；年平均相對濕度82%；有霜期12 d。

試驗點的土壤是由寒武系的砂巖發(fā)育而來的粉砂質(zhì)黏壤土質(zhì)地的富鋁濕潤富鐵土。土層厚度在60～100 cm 之間，平均坡度25°，土壤肥力中等，總面積約333 hm2。2002年闊葉林砍伐后煉山造林，15年間第5年一次共3 次進行萌芽再生造林后砍伐。施肥量為每年復(fù)合肥料0.5 kg/株（N∶P∶K=15∶6∶9）。2016年12月5日 至12月22日營造第1 代尾巨桉Eucalyptus urophylla×E.grandis，品種DH32-29，植苗行距為2 m×3 m，種植密度為1 750 株/hm2，隨后立即施基肥（液態(tài)碳肥+顆粒肥）第一年施0.5 kg/株30%有機肥，第2年到第4年施有機肥0.75 kg/株。采伐前的試驗地為第3 代5年生尾巨桉人工林，于2016年10月至11月上旬采伐主干。2016年11月10日至12月3日在采伐跡地上進行免煉山林地清理。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)地設(shè)置和試驗設(shè)計

在上述研究區(qū)典型區(qū)域中選擇14 hm2具有相似的自然條件的區(qū)域，于采伐前將研究區(qū)布置為3個大小相似的隨機區(qū)組，在每個區(qū)組中各建立3 種處理的一塊樣地，營造尾巨桉人工林，即每種處理均設(shè)置3 塊大小為20 m×20 m 的重復(fù)。3 種處理方式具體如下：1）平鋪處理（簡稱E）為將采伐剩余物按采伐時狀態(tài)均勻自然鋪于林地；2）堆放處理（簡稱S）為將剩余物沿山坡等高線以兩行樹苗為行距按2×3m 條形堆積在林地表面；3）移除處理（簡稱R）為將采伐剩余物全部移出林地；4）以采伐前的第3 代桉樹人工林作為對照（簡稱H）。

1.3 土壤樣品的采集與處理

于采伐前的第3 代桉樹人工林（2016年11月，簡稱H）、春季（2017年5月，簡稱R1、E1、S1）、夏季（2017年8月，簡稱R2、E2、S2）、秋季（2017年11月，簡稱R3、E3、S3）和冬季（2018年2月，簡稱R4、E4、S4）采集樣方內(nèi)土壤表層（0～20 cm）樣品。樣方取樣時，在每個標(biāo)準(zhǔn)地中，先去除土壤表層的腐殖質(zhì)及雜質(zhì)，在每個樣地中于0～20 cm 土層隨機收集五個子樣本，并均勻混合以形成大樣本。分兩部分帶回實驗室：一部分5～10 g 鮮土裝入10 mLPE 管作標(biāo)記后放入-80℃液氮罐保存，用于細菌群落的測量；另一部分約1 000 g裝入塑封袋，實驗室自然風(fēng)干，磨碎，分別過2、1 和0.149 mm 篩，用于測土壤化學(xué)性質(zhì)。

1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

根據(jù)Ling 等[34]的方法，使用去離子水和土壤混合（1∶2.5 土壤/水，w/v）的懸浮液中測定土壤pH 值。使用重鉻酸鉀法[35]，用定量的重鉻酸鉀-硫酸溶液，氧化土壤中的有機碳，剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計算出土壤有機質(zhì)（SOM）。使用凱式定氮法[36]，使土壤中的全氮在加速劑的作用下，用濃硫酸將全氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮后用氫氧化鈉堿化，加熱蒸餾出來的銨用硼酸吸收，以求出土壤全氮（TN）含量。通過氫氧化鈉熔融測量全磷（簡稱TP）和全鉀（簡稱TK），然后進行比色分析[37]，如用0.5 mol/L NaHCO3（pH 值8.5）提取可用的磷并用比色法定量。在氫氧化鈉熔融后通過火焰光度法測量土壤全鉀。

1.5 DNA 提取和PCR 擴增及測序

取樣后，采用CTAB 方法從0.5 g 解凍土壤樣品中提取DNA并使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，在細菌16S rRNA 基因擴增中使用引物對338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）。進行PCR，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，進行回收產(chǎn)物純化后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行回收產(chǎn)物檢測，定量。使用試劑盒進行建庫后利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進行測序。將所有樣本序列進行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（OTU），通常對97%相似水平下的OTU 進行生物信息統(tǒng)計分析。在OTU基礎(chǔ)上，計算各個樣品多樣性指數(shù)，對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學(xué)分析，閾值設(shè)置為0.8，并分別在各個分類水平上統(tǒng)計樣本的群落物種組成。

1.6 實時熒光定量PCR 分析

采用上述細菌通用引物對不同土壤樣品進行熒光定量PCR，用以確定細菌16s 基因拷貝數(shù)量。在PCR 儀中，PCR 反應(yīng)采用以下程序進行：95℃變性5 min，然后95℃循環(huán)35 次，30 s；53℃退火30 s；72℃延長時間60 s。每個PCR 反應(yīng)包含：10 μL 2X Taq Plus Master Mix，各0.8 μL5 μmol 正向與反向引物，7.4 μL dd H2O 和1 μL 模板DNA。標(biāo)準(zhǔn)曲線用十倍梯度稀釋構(gòu)建好的含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒得到的，利用回歸方程計算細菌rRNA 基因的拷貝數(shù)，將循環(huán)閾值（Ct）轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)中已知的拷貝數(shù)。熒光信號在PCR 過程中自動檢測。

1.7 微生物功能預(yù)測

為了識別樣本功能組，利用Tax4Fun 0.3.1 軟件包對16S rRNA 數(shù)據(jù)進行功能預(yù)測[38]。將基于Silva 數(shù)據(jù)庫的16S 分類譜系轉(zhuǎn)化為KEGG 數(shù)據(jù)庫[39]中原核生物的分類譜系；然后使用16S 拷貝數(shù)對相應(yīng)的KEGG 數(shù)據(jù)庫中原核生物的豐度進行標(biāo)準(zhǔn)化；最后利用均一化豐度數(shù)據(jù)，并結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫中原核生物與Silva 數(shù)據(jù)庫中16S分類譜系的對應(yīng)關(guān)系，對原核生物微生物群落的KEGG 功能預(yù)測。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫的信息，可以獲得Pathway 信息，并能根據(jù)OTU 豐度計算各功能類別的豐度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計分析均使用R 軟件3.4.3 版（R Core Team，2017）進行。使用基于Windows 的SPSS軟件v19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行單向ANOVA（單因素方差分析）用于測試不同保留采伐剩余物方式利用和采樣時間對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響。在整個分析中使用的數(shù)據(jù)均來自同一樣地所取3 次重復(fù)樣品的讀數(shù)的平均值。先使用Good 的覆蓋率用于確定細菌群落的序列覆蓋率。α 多樣性研究方法為利用Chao1 和Simpson 的均勻度指數(shù)與Ace 和Shannon 多樣性指數(shù)分別研究了土壤微生物群落的豐富度與均勻度。之后使用基于系統(tǒng)發(fā)育的加權(quán)weighted-unifrac 距離[40]完成對β-多樣性比較后,使用主坐標(biāo)分析（PCoA）用圖表視覺化樣品之間的差異。相關(guān)性 Heatmap 分析通過計算環(huán)境因子與所選物種之間的Spearman 相關(guān)系數(shù)，將獲得的數(shù)值矩陣通過Heatmap 圖直觀展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

桉樹人工林采伐剩余物的不同利用方式對土壤化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，移除處理的化學(xué)性質(zhì)表現(xiàn)出更為低于采伐前和其他處理方式，最高養(yǎng)分含量均出現(xiàn)在E 處理中，最低值則出現(xiàn)在R 處理中，但是差異大多不顯著（表1）。有機質(zhì)指標(biāo)最高值出現(xiàn)在E4，最低值出現(xiàn)在R1。pH 值指標(biāo)最高為H，最低為E2。全氮和全磷最高的為H，最低出現(xiàn)在R1，全鉀最高為E2,最低為R1。在全氮指標(biāo)R、E 和S 處理中均觀察到在隨采樣時間變化而顯著上升（P＜0.05），但沒有觀察到土壤有機質(zhì)、pH 值、全磷、全鉀的性質(zhì)隨時間出現(xiàn)顯著上升（P＞0.05）。

表1 采伐前和3 種采伐剩余物管理的土壤化學(xué)性質(zhì)?Table 1 Soil chemical properties before harvesting and management of three logging residues

2.2 不同采伐剩余物處理方式對土壤細菌群落α多樣性影響

土壤微生物群落多樣性、豐富度表現(xiàn)為對不同采伐剩余物處理方式的差異性響應(yīng)，其中移除處理的指數(shù)變化相比于其他處理更加顯著與劇烈（圖1，P＜0.05）。本研究在共39 個樣品中提取細菌基因序列，其中有效序列數(shù)范圍為35 451～65 774，平均序列數(shù)為45 918.05。經(jīng)過質(zhì)量過濾和重采樣后，以97%的序列相似性基于所有樣本中最小樣本序列數(shù)確定了5,105 個OTU。通過方差分析的指數(shù)組間差異檢驗，揭示了不同采伐剩余物處理和采樣時間之間的細菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)（ACE 豐富度，Chao 1 豐富度，Shannon 多樣性，Shannon 均勻度）。不同采伐剩余物處理方式對比顯示，Ace 和Chao 1 豐富度指數(shù)最低的3 個指數(shù)從低到高依次是R3、R4、S2，最高值出現(xiàn)在S1。Shannon 多樣性指數(shù)最低的3個指數(shù)從低到高依次是R1、H、S2，最高值出現(xiàn)在E4。Shannon 指數(shù)隨造林時間延長按春夏秋冬順序而逐漸升高。Simpson 均勻度指數(shù)最低的3 個指數(shù)從低到高依次是R2、S4、E4，最高值出現(xiàn)在R1。與Ace 和chao 豐富度指數(shù)相似，Shannon 指數(shù)隨造林時間延長按春夏秋冬順序而逐漸下降。

圖1 采伐前和3 種采伐剩余物管理的土壤細菌群落α 多樣性指數(shù)Fig.1 α diversity index of soil bacterial communities before logging and management of three logging residues

2.3 不同采伐剩余物處理方式和季節(jié)的動態(tài)變化對土壤細菌群落β 多樣性影響

對土壤細菌群落β 多樣性分析，揭示了季節(jié)和處理方式均對微生物群落有顯著影響，其中季節(jié)影響更顯著?；趙eighted-unifrac 距離進行PCoA 分析（圖2），第一主成分（PC1）能夠解釋51.45%的樣本，第二主成分（PC2）能夠解釋17.56%的樣本。3 種處理方式的OTU 在春季時仍有較高相似度，但是在夏季時群落分離程度開始增大，到秋季和冬季時，OTU 間仍然呈現(xiàn)較大程度分離。從圖2可知，在PCoA1 軸上，春夏時3 種處理方式的群落與秋冬時的3 種處理方式群落明顯分離。在PCoA2 軸上，除了R2 群落與其他采樣明顯分離，3 種處理方式的群落在同一季節(jié)時差異有限。PERMANOVA 分析表明，季節(jié)（R2=0.39013，P=0.001）和處理方式（R2=0.1277，P=0.021）對細菌群落的結(jié)構(gòu)有顯著（P＜0.05）影響。

圖2 根據(jù)采伐前和3 種采伐剩余物管理基于weighted-unifrac 距離的PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis based on weighted-unifrac distance according to pre-logging and three kinds of logging residue management

2.4 土壤細菌群落組成

土壤中的細菌群落在不同采伐剩余物處理方式和不同季節(jié)的影響下，細菌群落豐度呈現(xiàn)季節(jié)性動態(tài)變化，但細菌群落中的優(yōu)勢菌群基本相同（圖3）。土壤細菌群落有4 種相對豐度大于5%的優(yōu)勢菌群分別為：變形菌門Proteobacteria（29%～43%），酸桿菌門Acidobacteria（25%～42%）、綠彎菌門Chloroflexi（4%～17%）和放線菌門Actinobacteria（4%～12.5%）。還有4 種相對豐度大于2%的門，按豐度降序排列為厚壁菌門Firmicutes，疣微菌門Verrucomicrobia，浮霉菌門Planctomycetes，以及一種未分類菌Unclassified。在不同的處理和采樣時間上，優(yōu)勢菌群基本相同，但豐度具有較大差異。

圖3 Circos 樣本與物種關(guān)系圖譜Fig.3 Circos relationship between sample and species

對相對群落占比可能大于2%的細菌群落進行門水平分析發(fā)現(xiàn)，3 種采伐剩余物處理方式均顯著降低Acidobacteria的相對豐度，其中E 處理最大。3 種采伐剩余物處理方式均顯著降低Proteobacteri、Firmicutes、Verrucomicrobia的相對豐度，且其中R 處理下降幅度最大。3 種采伐剩余物處理方式均顯著降低unclassified的相對豐度，其中S 處理最大。3 種采伐剩余物處理方式均使得Chloroflexi、Actinobacteria的相對豐度顯著上升，且其中R 處理上升幅度最大。3 種采伐剩余物處理方式使得Planctomycetes的相對豐度顯著上升，且其中E 處理上升幅度最大。而在不同季節(jié)中，Chloroflexi相比于對照均含量顯著增加，其中冬季最大。Planctomycetes相比對照含量均顯著增加，其中秋季最大。Firmicutes、unclassified相比對照均含量顯著降低，其中秋天最低。Verrucomicrobia相比于對照含量均顯著降低，其中以冬天最低。

2.5 相關(guān)性Heatmap 分析

Heatmap 分析了揭示環(huán)境因素對主要微生物群落的影響，pH 值，TN，TP，SOM 含量是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，這些環(huán)境因子同5 種土地利用方式的土壤優(yōu)勢種群顯著相關(guān)（圖4）。其中pH 值和Proteobacteria、Firmicutes正相關(guān)，和Actinobacteria顯著正相關(guān)，和Planctomycetes負相關(guān)。TN 和Planctomycetes顯著正相關(guān)，和Acidobacteria、Firmicutes負相關(guān)，和Proteobacteria、unclassified顯著負相關(guān)，TP 和Actinobacteria顯著負相關(guān)。SOM 和Actinobacteria、Proteobacteria負相關(guān)。

圖4 土壤化學(xué)性質(zhì)和細菌群落的Spearman 相關(guān)性Heatmap 分析Fig.4 Heatmap analysis of Spearman correlation between soil chemical properties and bacterial community

2.6 土壤細菌功能貢獻預(yù)測

基于Tax4Fun 工具從16S rRNA 數(shù)據(jù)推斷不同改造措施土壤中細菌的功能貢獻，盡管各處理間分類功能圖譜較為相似，不同季節(jié)之間仍然存在20 條代謝通路的基因表達量差異達到顯著水平（Fig.6 ,P＜0.05）。所有土壤樣品共獲得6 565 KEEG Orthologues (KO)，主要屬于Metabolism,Environmental Information Processing,Genetic Information Processing 以 及Cellular Processes 等功能通路（Fig.5.A Fig.6.A）。與其他2 級功能通路 相比，Membrane transport,Signal transduction,Carbohydrate metabolism,Amino acid metabolism,Energy metabolism,Metabolism of cofactors and vitamins,Xenobiotics biodegradation and metabolism,Nucleotide metabolism,Translation,Lipid metabolism等功能通路相對豐度大于3.5%（Fig.5.B Fig.6.B）。盡管大部分功能通路基因豐度在不同處理間基本保持相對一致性，但在27 條相對豐度大于1%的3 級功能通路中，20 條與代謝相關(guān)的功能通路表達量存在顯著差異（P＜0.05），其中8 條通路的基因表達量表現(xiàn)為采伐前、春季和夏季顯著高于秋季和冬季。1 條通路的基因表達量表現(xiàn)為采伐前、春季、夏季和冬季顯著高于秋季，2 條通路的基因表達量表現(xiàn)為采伐前、春季、夏季和秋季顯著高于冬季。6 條通路的基因表達量表現(xiàn)為秋季和冬季顯著高于采伐前、春季和夏季。2 條通路的基因表達量表現(xiàn)為秋季顯著高于采伐前、春季、夏季和冬季。1 條通路的基因表達量表現(xiàn)為冬季顯著高于采伐前、春季、夏季和秋季。

圖6 Tax4Fun 分析（a.功能類別1；b.功能類別2）的不同季節(jié)間桉樹人工林土壤樣品中細菌功能貢獻預(yù)測Fig.6 Functional contribution prediction of bacteria in soil samples of Eucalyptus plantation in different seasons by Tax4Fun (a.functional category 1;b.functional category 2)

3 結(jié)論與討論

3.1 免煉山對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

研究發(fā)現(xiàn)在3 種采伐剩余物處理方式中，最高的養(yǎng)分含量均出現(xiàn)在E 處理，而最低均出現(xiàn)在R 處理中，3 種保留采伐剩余物的處理的化學(xué)性質(zhì)春季均低于采伐前，但是隨時間變化，3 種處理的化學(xué)性質(zhì)均呈現(xiàn)上升恢復(fù)的趨勢（表1）。這說明保留采伐剩余物的林地更新方式確實對土壤養(yǎng)分產(chǎn)生影響，且將采伐剩余物平鋪的方式相對地更有利于土壤養(yǎng)分恢復(fù)。在全氮指標(biāo)R、E 和S 處理中均觀察到在隨采樣時間變化而顯著上升（P＜0.05）。此外，雖然在冬季時氮磷鉀性質(zhì)都呈現(xiàn)平鋪處理顯著更高，在之前的采樣時間中都是平鋪處理有差異不顯著的相對最高值。這也與之前的一項研究的發(fā)現(xiàn)相似，類似的土地利用類型具有相似的土壤化學(xué)特性[41]。先前的研究還表明，動物堆肥通過增加土壤的碳庫來增加細菌和真菌的多樣性，從而改善土壤微生物種群的生活條件[42]。而堆肥（免耕）和免煉山對采伐剩余物的處理方式存在相似之處，同樣影響土壤有機碳。而土壤有機碳與土壤微生物生物量高度相關(guān)[43]。也有研究稱土壤微生物活性的增加與高土壤有效氮有關(guān)[44]。以前的研究表明，P 缺乏是紅壤作物生長的關(guān)鍵制約因素。而本研究的3 種免煉山處理都有同樣使用了30%有機肥，這可能是導(dǎo)致土壤化學(xué)性質(zhì)差異不顯著的原因之一。而采伐剩余物和有機肥的隨時間推移逐步分解也可能是全氮含量顯著上升現(xiàn)象的原因。

3.2 不同采伐剩余物處理方式和環(huán)境條件對土壤微生物群落多樣性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在土壤微生物的絕對豐度變化上，Ace 和Chao1 豐富度最低值有兩個出現(xiàn)在R處理，而且是秋冬季（圖1），這可能是因為移除了采伐剩余物導(dǎo)致了土壤暴露，導(dǎo)致了最低值出現(xiàn)。而S1 的最大值可能說明堆放處理在雨季到來之前的春季給土壤微生物提供了一個較高保護度的環(huán)境。Shannon 多樣性因為最低值出現(xiàn)在采伐前的H 和采伐后春季的R1，某種程度上反映了土壤細菌群落的受破壞程度，因此當(dāng)Shannon 指數(shù)最大值出現(xiàn)在E4 中，某種程度上可以說明E 處理在冬季時處于最大程度的混亂。Simpson 均勻度指數(shù)最高的兩個值是H 和R1，和Shannon 指數(shù)一樣，也在某種程度體現(xiàn)了，均勻度越高，土壤細菌群落越復(fù)雜越均勻。而最低值出現(xiàn)在R2，這可能是因為經(jīng)歷了雨季，移除處理R 中的細菌群落因為缺少采伐剩余物的保護，受到了巨大的擾動。此外，E 和R 處理在冬季均有相對較高的豐富度和相對較低的均勻度，這可能說明，在豐富度回升的過程中，導(dǎo)致了必然的短期混亂，即均勻度下降。因此可能需要時間跨度更大的研究來探究土壤細菌群落組成煉山后的變化。

在使用基于weighted-unifrac 距離的PCoA 分析β 多樣性后，本研究發(fā)現(xiàn)3 種不同處理方式和采伐前的細菌群落在春季時仍有較高相似度，但是在夏季時群落分離程度開始增大，到秋季和冬季時，3 種處理方式之間的群落間仍然呈現(xiàn)較大程度分離。PERMANOVA 分析進一步表明，季節(jié)和處理方式均對細菌群落的結(jié)構(gòu)有顯著影響。先前已有研究已發(fā)現(xiàn)到微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化[45-46]，但是Jangid 等[47]的研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)輸入對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于季節(jié)。在這項研究中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤資源相關(guān)的事實表明微生物群落可能對資源投入的變化更敏感。此研究結(jié)果也證實了其他研究人員的結(jié)果，土壤細菌群落組成與土壤和植物性質(zhì)以及植物-微生物相互作用相關(guān)[48-49]。殘留物管理處理確實影響了土壤微生物組[50]。這與其他研究結(jié)果一致，這些研究在較少擾動的耕作制度下觀察到較高的微生物群落Shannon 多樣性[51]。同時本研究也和其他研究有相似的發(fā)現(xiàn)，Nevins 等的研究表明：在處理方式之間的對比時，不同殘留物管理處理對β 多樣性沒有顯著影響[52]。

3.3 不同采伐剩余物處理方式對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)改變及潛在功能預(yù)測

在3 種處理中，Proteobacteria相對豐度的最低值出現(xiàn)在R 處理中，而最高出現(xiàn)在E 處理中（圖3），與之前對于土壤質(zhì)量的研究相符合，且本研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria4 種菌門均易受到季節(jié)變化的影響。Actinobacteria被認為參與了有機物的降解，與Proteobacteria一同被認為具有在營養(yǎng)充足環(huán)境下活性增大的特性，在土壤有機碳含量高的條件下蓬勃發(fā)展[53-58]，而本研究發(fā)現(xiàn)，造林后3 種處理方式均會導(dǎo)致Proteobacteria的相對豐度下降，而R 處理中的Proteobacteria的下降幅度最大，3種處理方式之間E 最大，這也與之前研究結(jié)果相符，林地更新均會導(dǎo)致土壤影響損失，而3 種處理中R 處理中土壤營養(yǎng)含量最低，而E 處理相對最高。而Proteobacteria在本研究中卻與TN 極顯著負相關(guān)（圖4），這可能是由于季節(jié)變化使得TN 的增加反而抑制了Proteobacteria，因為在本次試驗中，旱季（秋季和冬季）中Proteobacteria的相對豐度顯著低于雨季（春季和夏季）。而與之相反的情況出現(xiàn)在Actinobacteria上，該菌門出現(xiàn)了和TP 的顯著負相關(guān)，且Actinobacteria菌門在旱季中的相對豐度顯著高于雨季。這也和前人關(guān)于相近降雨狀況的研究存在相似之處[59-62]，如巴西卡廷加森林的土壤中雨季中Proteobacteria，Acidobacteria和Bacteroidetes的增加相反，干旱季節(jié)發(fā)現(xiàn)了Actinobacteria和Cyanobacteria的顯著富集[33]。而Chloroflexi和Acidobacteria兩個菌門被認為和有機物降解如纖維素有關(guān)[63,64]，如前人研究發(fā)現(xiàn)Chloroflexi相對豐度同土壤有機質(zhì)含量存在負相關(guān)關(guān)系[65,66]，但是本研究結(jié)果與前人結(jié)果存在差異，這可能是因為此兩個菌門也與干濕季節(jié)有關(guān)，而受干濕季節(jié)影響這一點在Acidobacteria上也有所體現(xiàn)，旱季中Acidobacteria的相對豐度顯著低于雨季。

為了能夠更深入了解人工林改造措施對林地土壤細菌群落的影響，本研究采用預(yù)測效果優(yōu)于PICRUST 的Tax4Fun 對各處理進行原核生物微生物群落KEGG 功能預(yù)測[38]。與以往類似研究結(jié)果相似[67]，本研究發(fā)現(xiàn)不同處理細菌metabolic category 相對豐度具有高度一致性，這可能歸因于土壤中眾多不同類型細菌具有相似的核心功能[68]。本研究表明，土壤細菌參與了多條KEEG 途徑（圖5～6），大多數(shù)細菌與代謝途徑有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)相對豐度大于1%的26 條3 級功能通路中，有20 條在4 個季節(jié)之中表達的功能通路基因豐度出現(xiàn)顯著差異?？傮w來說，在采伐前和雨季（春季和夏季）中基因表達量大于旱季（秋季和冬季）通路中，主要功能為環(huán)境信息處理中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝中的核苷酸嘌呤代謝與碳水化合物代謝、細胞的運動生長和死亡有關(guān)，均與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和細菌群落的生長擴張有關(guān)。而在旱季（秋季和冬季）通路中基因表達量較大的通路，功能與環(huán)境信息處理的膜轉(zhuǎn)運、代謝中的氨基酸代謝、新陳代謝中的能量代謝和輔因子和維生素的代謝有關(guān)，從通路名稱可以看出這些通路都與能量的儲存和細菌群落的能量平衡有關(guān)。這一結(jié)果也進一步驗證了本研究的假設(shè)，土壤中的細菌群落確實會受到林地更新的影響而激活，并且會隨著季節(jié)變化出現(xiàn)能量的釋放使用和儲存維持的現(xiàn)象。

圖5 Tax4Fun 分析（a.功能類別1；b.功能類別2）的不同采伐剩余物處理方式間桉樹人工林土壤樣品中細菌功能貢獻預(yù)測Fig.5 Functional contribution prediction of bacteria in soil samples of Eucalyptus plantations under different logging residue treatments analyzed by Tax4Fun (a.functional category 1;b.functional category 2)

3.4 對采伐剩余物管理工作的啟示

本研究之所以獨特，是因為它探索了不同采伐剩余物處理方式和季節(jié)對土壤化學(xué)性質(zhì)和細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響，從而改善了土壤生物環(huán)境和肥力。本研究中揭示了不同的采伐剩余物處理方式會較大影響土壤的化學(xué)和微生物特性。通過對土壤化學(xué)性質(zhì)的研究，本研究發(fā)現(xiàn)，相對而言E 處理能最大程度地恢復(fù)土壤肥力，而R 處理恢復(fù)土壤肥力的能力相對最差。而在對土壤微生物多樣性的研究中，研究發(fā)現(xiàn)R 處理會導(dǎo)致土壤微生物豐富度在夏季至秋季間出現(xiàn)大幅下降，均勻度會在春季至夏季間大幅下降，這種變化幅度極大的曲線很可能暗示了R 處理下的土壤環(huán)境十分不穩(wěn)定。因此根據(jù)本研究結(jié)果，不建議繼續(xù)使用移除采伐剩余物的處理方式，而平鋪采伐剩余物處理方式是三者中相對更好的選擇。

而對土壤化學(xué)性質(zhì)和細菌群落的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)了，TN 不僅對于桉樹的生長有重要作用，也對土壤細菌群落的變化有著很大的影響力。但是關(guān)于土壤氮和細菌群落之間的相互影響機制的研究仍然不夠深入，因此基于本研究的啟示是，及時監(jiān)控土壤N 含量變化和細菌群落的變化，因為現(xiàn)在的研究并不能排除存在過量的N 添加如施肥導(dǎo)致土壤細菌群落失衡的風(fēng)險。

3.5 不同采伐剩余物管理方式差異性探討的階段性總結(jié)和展望

本研究結(jié)果表明，對比3 種采伐剩余物處理方式化學(xué)性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)隨時間變化，3 種處理的化學(xué)性質(zhì)均呈現(xiàn)上升恢復(fù)的趨勢。且恢復(fù)速度上是E＞S＞R。3 種采伐剩余物處理方式在秋冬季相比于采伐前降低了細菌群落的豐富度和均勻度并增加了多樣性，其中R 處理的變化幅度最大。在3 種處理中，Proteobacteria相對豐度的最低值出現(xiàn)在R 處理中而最高出現(xiàn)在E 處理中，且Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi和Acidobacteria4 種菌門均易受到季節(jié)變化的影響。在采伐前和雨季（春季和夏季）中基因表達量大于旱季（秋季和冬季）通路均與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和細菌群落的生長擴張有關(guān)，而在旱季（秋季和冬季）通路中基因表達量較大的通路，功能與環(huán)境信息處理的膜轉(zhuǎn)運、代謝中的氨基酸代謝、新陳代謝中的能量代謝和輔因子和維生素的代謝有關(guān)，從通路名稱可以看出這些通路都與能量的儲存和細菌群落的能量平衡有關(guān)。pH 值和Actinobacteria、unclassified顯著正相關(guān)。TN 和Planctomycetes顯著正相關(guān)，和Proteobacteria、unclassified顯著負相關(guān)，TP 和Actinobacteria顯著負相關(guān)，說明了氮含量變化和土壤細菌群落變化值間存在重要聯(lián)系。綜上所述，采用平鋪采伐剩余物處理方式是三者中相對更優(yōu)的選擇。而關(guān)于土壤N 含量變化和細菌群落的變化之間的深層機制需要進一步研究探討。