余世洲，楊志曉，余婧，宋時浩，張孝廉，趙會納，張長云，林英超，雷波*

普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族抗逆基因篩選與表達分析

余世洲1，楊志曉1，余婧1，宋時浩2，張孝廉1，趙會納1，張長云1，林英超1，雷波1*

1貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081；2青島頤中科技有限公司，青島市市北區(qū)沾化路3號甲 266011

【】NAC（NAM/ATAF/CUS2）家族是植物特有且最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫應(yīng)答。為篩選煙草抗逆目標(biāo)基因。以公開的普通煙草品種K326的注釋蛋白序列為參考，與擬南芥NAC蛋白序列同源比對，結(jié)合功能域分析，進行普通煙草的NAC轉(zhuǎn)錄因子鑒定，并利用生物信息學(xué)軟件分析各煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)及系統(tǒng)進化關(guān)系。使用普通煙草TobEA表達譜數(shù)據(jù)對煙草NAC家族成員組織表達模式進行分析，通過qRT-PCR檢測候選抗逆基因所在亞組AtNAC3和ATAF各成員在干旱、冷害、鹽、ABA處理下的基因表達情況。從普通煙草中共鑒定出190個NtabNAC蛋白，平均氨基酸長度為347，除NtabNAC190外，其余蛋白為親水性蛋白，大多數(shù)定位在細(xì)胞核。根據(jù)系統(tǒng)進化分析，將擬南芥和煙草NAC家族基因劃分為18個亞組，各亞組基因在不同組織中顯示表達特異性。AtNAC3和ATAF亞組的9個煙草基因，在受到干旱、冷害、鹽和ABA處理后基因表達量上調(diào)，且、和表達量變化最為明顯。、和參與了煙草植株的逆境脅迫調(diào)控，研究結(jié)果有助于煙草抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析和后續(xù)抗逆育種。

普通煙草；NAC基因家族；轉(zhuǎn)錄因子；系統(tǒng)發(fā)育；表達模式；非生物脅迫

圖1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)

Ooka等[8]依據(jù)基因序列結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系，將105個擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子和75個水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子劃分為兩大類18個亞組。其中NAC1和NAM亞組中的基因多參與植株形態(tài)發(fā)育過程，如葉片衰老、種子和胚胎發(fā)育、細(xì)胞分裂、莖尖分生組織形成、纖維發(fā)育、花的形態(tài)發(fā)生及側(cè)根發(fā)育等[10-11]。AtNAC3和ATAF亞組基因則多與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)，NAP、NAM和OsNAC3亞組中有少數(shù)基因也具有這一功能[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥植株中過表達AtNAC3亞組中的、和基因，植株的耐旱性顯著提高[13]。在水稻中過表達基因可以促進葉片氣孔關(guān)閉，減少水分損失，從而增強過表達植株的耐旱性和耐鹽性[14]；在擬南芥中過表達玉米NAC轉(zhuǎn)錄因子可提高植株的耐旱性[15]。在小麥中過表達基因或基因能促進根的生長，提高水分利用效率，從而增強植株的耐旱能力[16-17]。

普通煙草（L.）的形態(tài)發(fā)育對環(huán)境因素較為敏感，近年來國內(nèi)多個煙區(qū)受到干旱、低溫等不良環(huán)境的影響[18]。已有研究報道了[19][20]、[21]等基因的抗旱功能，但這些研究都是從單個基因出發(fā)，并未從基因組層面進行系統(tǒng)分析?；诖耍狙芯坷?017年公開的普通煙草品種K326基因組序列數(shù)據(jù)[22]，通過同源比對的方法對普通煙草的NAC轉(zhuǎn)錄因子進行全基因組鑒定，并結(jié)合表達模式分析，以期篩選出參與非生物逆境脅迫應(yīng)答的候選NAC轉(zhuǎn)錄因子，為普通煙草抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析和抗逆品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以普通煙草品種K326為供試材料，種子由貴州省煙草科學(xué)研究院提供。植物多酚RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗處理

使用漂浮育苗方式育苗，將漂浮盤置于人工氣候室中，條件為28 ℃光照16 h，20 ℃黑暗8 h。出苗4周后將幼苗取出，用清水沖洗根部，隨后用吸水紙吸干水分后，置于滅菌水培養(yǎng)1周。結(jié)合前期預(yù)實驗及相關(guān)文獻報道進行脅迫處理：干旱（20% PEG6000 溶液）、鹽害（50 mmol/L NaCl溶液）、ABA（100mmol/L）、冷害（置于4 ℃人工氣候箱）[15,20-21]。分別在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h對各處理煙株根系進行取樣，同時取未經(jīng)處理的樣品作為對照。所取樣品立即置于液氮中保存，試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

從茄科物種基因組數(shù)據(jù)庫（SGN，https:// solgenomics.net）下載普通煙草品種K326的基因組序列及注釋文件，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org）下載隱馬爾可夫模型文件（PF02365），利用HMMER3.1b2軟件（http://hmmer.org/）進行普通煙草NAC蛋白序列的初步檢索，閾值（E-value）設(shè)為1.0，將初步獲得的蛋白序列作為檢索序列，利用Blastp軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同K326基因組所有蛋白序列進行比對，參數(shù)為默認(rèn)。所有HMMER和Blastp獲得序列結(jié)果分別用InterProScan （https://www.ebi.ac.uk/interpro）、SMART （http:// smart.embl-heidelberg.de）和NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/ bwrpsb.cgi）進行蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測，對上述3個工具軟件分析結(jié)果中含有NAC功能域的蛋白列表求交集，再刪除氨基酸序列長度低于110的蛋白序列，剩余序列作為普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列，按各序列對應(yīng)基因在參考基因組連鎖群上的位置順序依次命名。

1.3.2 序列特征分析

對獲得的普通煙草NAC蛋白序列的分子量、等電點（PI）選擇使用EXPasy（http://web.expasy.org/ protparam）進行分析；跨膜結(jié)構(gòu)域分析選擇使用TMHMM server v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?TMHMM-2.0)；蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測選擇使用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell-PLoc-2）。以上分析工具均為網(wǎng)頁在線工具，參數(shù)選擇默認(rèn)。

本文中選擇的仿真頻率為1.5 GHz，該頻率是導(dǎo)航衛(wèi)星信號的主要頻率，目標(biāo)為空客A320和 F-15C型戰(zhàn)斗機，材料為金屬，采用商用軟件CST進行電磁計算，采用的方法為快速多層多極子算法，以1°為間隔對目標(biāo)模型進行仿真。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育、序列結(jié)構(gòu)和蛋白Motif分析

從擬南芥基因組網(wǎng)站（TAIR 9.0，http://www. arabidopsis.org）下載105個擬南芥NAC蛋白序列，使用Clustal W軟件[23]將擬南芥NAC蛋白序列和煙草NAC蛋白序列進行多序列比對，利用MEGA7.0軟件[24]的最大似然估計方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1000。用MEME軟件（http://meme-suite.org/tools/ meme）對煙草NAC蛋白進行Motif分析，同時選擇K326基因組GFF3注釋文件，利用TBtools工具（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）對獲得的煙草NAC蛋白和基因結(jié)構(gòu)進行可視化展示。

1.3.4 組織表達模式分析

從EMBL-EBI網(wǎng)站（https://www.ebi.ac.uk）下載普通煙草TobEA表達譜數(shù)據(jù)[25]，該數(shù)據(jù)包含種子、子葉、幼芽、幼根、成熟根、下部莖、上部莖、莖頂端、幼葉、莖生葉、成熟葉、早期衰老葉、中早期衰老葉、中后期衰老葉、后期衰老葉、未開花蕾、開放花蕾、花朵與花頂端共計19個樣品組織，貫穿煙草生長發(fā)育的整個生命周期。從https://link.springer.com/article/10. 1186/1471-2164-11-142網(wǎng)頁下載表達譜對應(yīng)的CDS序列，利用Blastn程序?qū)tabNAC家族成員CDS序列比對，max_target_seqs設(shè)置為1，其余參數(shù)為默認(rèn)，獲得各成員對應(yīng)的表達譜基因編號。對獲得的表達數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)合進化關(guān)系，分析普通煙草NAC家族成員的表達模式并預(yù)測功能。

1.3.5 實時熒光定量PCR驗證

根據(jù)進化關(guān)系和1.3.4中的表達模式分析結(jié)果，篩選抗逆候選NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，選用煙草基因（NTU60495）為內(nèi)參基因，根據(jù)序列特異性分別設(shè)計引物（表1），利用TaKaRa公司Taqman探針試劑盒在ABI SteponePlus實時熒光定量PCR儀上進行qPCR實驗，采用2-ΔΔCt相對定量法分析候選基因?qū)Ω珊?、鹽、ABA和冷害脅迫處理的響應(yīng)，對照樣本各基因表達量作為標(biāo)準(zhǔn)1。

表1 部分普通煙草基因qRT-PCR引物

Tab.1 qRt-PCR primers for part of Nicotiana tabacum L.NAC genes

2 結(jié)果與分析

2.1 普通煙草NAC家族序列鑒定及特征分析

利用HMMER和Blastp程序?qū)ζ胀煵萜贩NK326蛋白序列比對分析，初步獲得276個非冗余候選NAC蛋白序列，結(jié)構(gòu)功能域分析和剔除氨基酸長度低于110的蛋白序列后，最終獲得190個普通煙草NAC家族基因，按照基因在連鎖群上的順序以依次進行編號。分析序列的理化性質(zhì)結(jié)果顯示（附表1，http://ycxb.tobacco.org.cn/ news/video/0f7fbdbf-27af-473e-af81-c7d59bbaf89a.htm），這些蛋白的平均氨基酸長度為347，范圍在129～992之間；平均分子量為39537.87 Da，范圍在14666.30～113371.89 Da之間；平均等電點為6.82，范圍在4.47～9.76之間；平均脂肪族氨基酸指數(shù)為66.87，范圍在49.75～112.86之間；平均疏水性指數(shù)為-0.673，范圍在-1.096～0.22 之間，僅NtabNAC190的疏水性指數(shù)大于0，為0.22，表明該蛋白為疏水性蛋白，其余NAC家族蛋白全部表現(xiàn)為親水性。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因定位結(jié)果為葉綠體和細(xì)胞核，基因定位結(jié)果為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其余結(jié)果均定位到細(xì)胞核內(nèi)；跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示17個蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)，其中13個蛋白（NtabNAC014、NtabNAC026、NtabNAC035、NtabNAC041、NtabNAC096、NtabNAC121、NtabNAC123、NtabNAC131、NtabNAC138、NtabNAC139、NtabNAC140、NtabNAC181、NtabNAC184）含有1個跨膜結(jié)構(gòu)，3個蛋白（NtabNAC048、NtabNAC057、NtabNAC120）含有2個跨膜結(jié)構(gòu)，1個蛋白NtabNAC185含有4個跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 普通煙草NAC家族進化分析

將擬南芥全基因組105個NAC家族氨基酸序列和研究獲得的190個普通煙草NAC家族氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。參照前人研究結(jié)果[8]，將擬南芥和普通煙草的NAC蛋白劃分為18個亞組，各亞組命名及含有的擬南芥和普通煙草NAC蛋白見圖2，其中NtNAC和ANAC104亞組為新命名。在構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹上，NtNAC亞組包含16個普通煙草NAC蛋白，這些蛋白組成一個簇，且無擬南芥NAC蛋白存在，在進化關(guān)系上顯示出一定的特異性，因此將其命名為NtNAC亞組。因ANAC104亞組僅含有1個擬南芥NAC蛋白ANAC104，而ANAC104在Ooka等[8]的研究中，在亞組上未有明確歸屬，本研究將該亞組命名為ANAC104，同時將8個普通煙草NAC蛋白劃分到該亞組。剩余16個亞組中，含有普通煙草NAC蛋白的數(shù)目分別為4～26個，其中OsNAC7亞組和NAM亞組含有的普通煙草NAC蛋白數(shù)量較多，分別有26和25個，與抗逆脅迫相關(guān)的亞組AtNAC3和ATAF分別含有4個和5個普通煙草NAC蛋白。

圖2 普通煙草與擬南芥NAC 蛋白系統(tǒng)進化樹

2.3 普通煙草NAC基因組織表達模式分析

對分析獲得的190個普通煙草基因與煙草表達譜（TobEA）包含的序列進行Blastn比對，結(jié)果共有80個普通煙草基因在煙草表達譜中檢索到表達數(shù)據(jù)。這80個基因分布在15個亞組（除ANAC063亞組）中，結(jié)合表達譜注釋文件、進化樹信息及擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫信息，將檢索到的80個基因及其同源表達譜基因ID、擬南芥基因序列號進行匯總整理，同時依據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫注釋信息，對每個亞組基因的功能進行預(yù)測，結(jié)果見表2。

表2 部分普通煙草基因?qū)?yīng)表達譜和擬南芥基因序列號及預(yù)測基因功能

Tab.2 Expression profile ID of some NAC genes in Nicotiana tabacum L., Arabidopsisthaliana ID and prediction of gene function

續(xù)表2

亞組Group基因名稱Gene Name煙草表達譜序列號TobEA IDANAC 名稱ANAC NameANAC序列號ANAC ID別名Other name基因功能Gene function SENU5NtabNAC013CV021715ANAC083AT5G13180NAC083, T19L5.140, VNI2調(diào)控木質(zhì)部導(dǎo)管形成 NtabNAC177 NtabNAC018C4770 NtabNAC061 NtabNAC034C3485 NtabNAC179BP131326 AtNAC3NtabNAC087BP128761ANAC072AT4G27410F27G19.10, NAC072, RD26受干旱、鹽害、冷害、脫落酸誘導(dǎo)，參與脫落酸介導(dǎo)的水分調(diào)控 NtabNAC111EB434749 ATAFNtabNAC045C5212ANAC102AT5G63790ATAF2，MBK5.27, NAC102參與脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成，受機械損傷、生物逆境和非生物逆境誘導(dǎo) NtabNAC065EB437400 NtabNAC092C10228ANAC002AT1G01720ATAF1, NAC002, T1N6.12 NtabNAC170 NAPNtabNAC001TT06_M17ANAC056AT3G15510ATNAC2, MJK13.17, NAC056, NAC2, NARS1葉片衰老、芽發(fā)育、逆境脅迫 NtabNAC002 NtabNAC005 NtabNAC043EB425871ANAC029AT1G69490ATNAP, F10D13.14, NAC029, NAC29, NAP NtabNAC101 NtabNAC107C10525 NtabNAC100TT16_L09ANAC047AT3G04070NAC047, SHG, SHYG ANAC104NtabNAC050TT10_P18ANAC104AT5G64530MUB3.5, NAC104, XND1 NtabNAC154 NAC1NtabNAC029EB444571ANAC074AT4G28530NAC074調(diào)控柱頭組織的程序性細(xì)胞死亡 NtabNAC067 NtabNAC143 NAMNtabNAC016BP526410ANAC087AT5G18270 正調(diào)控衰老；誘導(dǎo)葉片細(xì)胞死亡和衰老；在衰老和葉綠素調(diào)節(jié)中起作用；與植株形態(tài)發(fā)育相關(guān) NtabNAC022 NtabNAC152 NtabNAC089C4769ANAC100AT5G61430AT5G61430 NtabNAC137ANAC079AT5G07680NAC080, NAC4 NtabNAC148ANAC080 NtabNAC028DW004957ANAC058AT3G18400NAC058 NtabNAC059 NtabNAC161 NtabNAC008TT16_C05ANAC092AT5G39610ATNAC2, ATNAC6, NAC2 NtabNAC040ANAC059AT3G29035ATNAC3, NAC3, ORE1 NtabNAC056ANAC046AT3G04060NAC046 NtabNAC075 NtabNAC062EB683185ANAC039AT2G24430 NtabNAC133

注：含有‘*’表示煙草表達譜序列號出現(xiàn)了2次。

依據(jù)表達譜數(shù)據(jù)，對基因序列進行聚類分析，將19個組織分為3個類群（圖3）。組織類群A主要為成熟的葉、花等相關(guān)衰老組織，B主要為種子、子葉、莖尖、幼葉等幼嫩組織，C主要為根、莖、花芽等組織?；蚓垲惤Y(jié)果表明45個基因分為4個類群，其中基因類群I、III的基因表達量結(jié)果相對高于II、IV，且不同組織類群間的基因表達差異更顯著。4個基因類群兩兩比較，基因類群I的表達量總體高于其他3個類群，且在成熟衰老組織類群A中的表達量與另外2個組織類群相比呈現(xiàn)相對較高的態(tài)勢?；蝾惾篒I的基因表達量在4個類群中最低，且在3個組織類群中的表達量差異不明顯?；蝾惾篒II的基因表達量與其他3個基因類群相比，表達量處于中間偏上水平，且在各組織類群間表現(xiàn)明顯差異。值得注意的是，在普通煙草NAC基因家族中，主要和逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的AtNAC3和ATAF亞組的基因并沒呈現(xiàn)出趨同表達的情況。如AtNAC3亞組中，煙草表達譜序列號為EB434749和BP128761的2個序列，前者基因聚類到基因類群I，而后者則劃分到基因類群II，二者的表達模式完全不同，ATAF亞組中基因也表現(xiàn)出類似情形。

圖3 煙草NAC基因家族基因表達熱圖

2.4 普通煙草NAC基因結(jié)構(gòu)和蛋白Motif分析

利用擬南芥、普通煙草參考基因組注釋信息，對2個物種NAC基因家族的基因結(jié)構(gòu)、蛋白功能域模式（Motif）進行分析，其中AtNAC3和ATAF亞組的分析結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，本研究劃分的亞組內(nèi)基因結(jié)構(gòu)和功能域模式表現(xiàn)呈一致性，亞組間則差異明顯。NAC蛋白功能域中2個保守子域C、D在2個亞組間則差異明顯。NAC蛋白功能域中2個保守子域C、D在2個亞組間存在差異特征，其中AtNAC3亞組蛋白保守子域C（motif 3）中，甘氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸序列（GTD）在ATAF亞組變?yōu)楦拾彼?丙氨酸-天冬氨酸序列（GAD）。在保守子域D中，存在于AtNAC3亞組蛋白中甘氨酸-蘇氨酸-賴氨酸序列（GTK），在ATAF亞組中變?yōu)楦拾彼?谷氨酸-賴氨酸序列（GEK）或甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸序列（GIK）。這些特征分化明顯，可作為區(qū)分2個亞組成員的序列特征。根據(jù)基因組注釋信息顯示，2個物種的ATAF亞組基因的結(jié)構(gòu)都有3個外顯子和2個內(nèi)含子，蛋白模式中NAC功能域都由motif 1、2、3、8、5組成，表明2個物種的ATAF亞組基因分化程度較小。與之相比，AtNAC3亞組基因則在2個物種中結(jié)構(gòu)和蛋白模式有明顯的分化，其中基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目各增加1個，而基因則增加2個，同時發(fā)現(xiàn)和基因的內(nèi)含子序列長度也明顯增加。蛋白序列多重比較及蛋白模式結(jié)果表明，NtabNAC105蛋白的子域A丟失了motif 1，NtabNAC087和NtabNAC111蛋白的子域B則發(fā)生變異，其motif 2 分別變成了motif 6，motif 6 + motif 7。基因的結(jié)構(gòu)、蛋白模式與擬南芥AtNAC3亞組基因相比，表現(xiàn)基本一致。

圖4 AtNAC和ATAF亞組煙草基因序列結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域

2.5 普通煙草AtNAC3和ATAF亞組基因逆境處理下表達特征

qRT-PCR試驗結(jié)果表明煙草幼苗在遭受逆境脅迫處理后，AtNAC3和ATAF亞組的9個基因在根部的表達量均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，但不同基因上調(diào)程度差異顯著，其中、和上調(diào)最為明顯。從時間梯度分析，除外，其余基因受脅迫處理后，基因表達量多在1～3 h內(nèi)達到最高。2個亞組內(nèi)基因相比，和在AtNAC3亞組，二者的表達變化趨勢基本相同，但二者對應(yīng)的直系同源基因與之相比，在遭受逆境脅迫處理后，表達量變異范圍顯著變小，同時ATAF亞組的基因與同亞組基因相比表現(xiàn)出相同趨勢。另外，值得注意的是和在受ABA處理后，表達量顯著增加，而變化不顯著。

圖5 普通煙草AtNAC3和ATAF亞組NAC基因在逆境脅迫下基因表達模式

3 討論

基因是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長發(fā)育和生物脅迫應(yīng)答[26]。普通煙草作為一個典型的模式生物，具有易轉(zhuǎn)化、生物量大和對環(huán)境敏感等特點，系統(tǒng)研究和鑒定煙草中的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，對煙草及其他作物生物學(xué)研究都具有重要意義。早期的普通煙草NAC基因家族研究分別鑒定出152和154個基因[27-28]，而植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（PlantTFDB V5.0，http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）則收錄有280個預(yù)測的普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子序列，以上結(jié)果對系統(tǒng)研究普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子造成一定困擾。本研究利用2017年公開的K326基因組序列[22]及相關(guān)數(shù)據(jù)共鑒定出190個普通煙草NAC蛋白，多于前期研究發(fā)現(xiàn)的152個和154個，這是普通煙草參考基因組不斷完善帶來的結(jié)果。本研究利用HMMER和Blastp程序獲得的276個原始基因列表，同PlantTFDB數(shù)據(jù)庫收錄的煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子列表結(jié)果相當(dāng)，但其中部分序列不含有NAC功能域。

序列比對、結(jié)構(gòu)分析和進化分析結(jié)果表明，同一個亞組上的蛋白序列和結(jié)構(gòu)相似程度很高，不同亞組間則有一定區(qū)別，這可能和NAC功能分化相關(guān)。在劃分的18個亞組中，AtNAC3和ATAF亞組是擬南芥中被報道和參與逆境脅迫最多的2個亞組[9]，水稻[14]、玉米[15]和[16]等基因與這2個亞組的擬南芥基因高度同源。本研究共有9個煙草基因劃分到這2個亞組，與擬南芥基因相比，普通煙草基因存在多倍化造成的基因加倍現(xiàn)象。如基因，在煙草中具有和兩個直系同源基因，這2個基因就是由普通煙草的2個祖先種林煙草和絨毛狀煙草基因組融合導(dǎo)致。同時這2個亞組中煙草基因結(jié)構(gòu)與擬南芥的結(jié)構(gòu)上發(fā)生一些變化，如擬南芥及其他物種基因在這2個亞組中多為3個外顯子和2個內(nèi)含子[29-30]，但在本研究中，這2個亞組中的、、和等基因的外顯子和內(nèi)含子都發(fā)生增多，造成基因結(jié)構(gòu)多樣性的變化，這種變化可能會造成基因功能的改變，影響植物對環(huán)境的適應(yīng)性[31]。

基因表達模式分析結(jié)果表明，AtNAC3和ATAF亞組中基因，在各組織間以及遭受逆境脅迫后，基因表達量變化存在顯著差異，原因可能是基因序列結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致基因功能產(chǎn)生變化，2個直系同源基因中的一個喪失了逆境脅迫調(diào)控應(yīng)答功能，但更可能是普通煙草在進化過程中，由于染色體加倍造成2個直系同源基因僅一個基因發(fā)揮功能，簡稱基因功能冗余[32]。本研究中，AtNAC3亞組和ATAF亞組分別包含4個和5個基因，其中、和在受脅迫處理后，相較其基因的表達量，變化更為顯著，且值得注意的是AtNAC3亞組中的、兩個基因受ABA處理處理后的表達量變化與相比存在差異。前人研究表明AtNAC3亞組基因，對干旱、鹽害、低溫等多個非生物逆境皆有響應(yīng)[33]，ATAF亞組中等基因除和非生物脅迫相關(guān)外，還參與生物脅迫的調(diào)控[34]。綜合表2和前人研究結(jié)果，推測AtNAC3亞組基因可能參與植物體內(nèi)ABA代謝途徑，而ATAF亞組基因則可能和茉莉酸（JAs）、水楊酸（SA）等代謝途徑更為密切[12,15,35]。

4 結(jié)論

本研究利用公開的普通煙草參考基因組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)鑒定了普通煙草NAC家族基因，并對這些基因的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)變異、系統(tǒng)發(fā)育及表達模式進行分析，主要發(fā)現(xiàn)：（1）鑒定的190個基因具有典型的轉(zhuǎn)錄因子特征，主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。（2）根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系，將普通煙草和擬南芥NAC蛋白劃分為18個亞組，不同亞組之間的結(jié)構(gòu)和功能存在差異，其中AtNAC3和ATAF亞組是普通煙草基因響應(yīng)脅迫的重點關(guān)注對象。（3）、和可作為NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中，研究煙草抗逆的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和后續(xù)抗逆育種的重點關(guān)注基因，且可能涉及不同代謝調(diào)控途徑。

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Identification and expression analyses of the NAC transcription factor family inL.

YU Shizhou1, YANG Zhixiao1, YU Jing1, SONG Shihao2, ZHANG Xiaolian1, ZHAO Huina1, ZHANG Changyun1, LIN Yingchao1, LEI Bo1*

1 Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China;2 Qingdao Etsong Technology Co.,Ltd., Qingdao 266011, China

NAC (NAM/ATAF/CUS2) gene family, as one of the unique and largest transcription factor families of plants, is widely involved in development regulation and stress response of plants.Based on the available reference genome of(K326), we tried to identify NAC family by motif analysis and homolog search with. Moreover, the tissue expression patterns, physicochemical properties and phylogenetic relationships for these NACs were predicted using bioinformatics strategy. Moreover, qRT-PCR assays were performed to examine expression patterns of thesegenes in AtNAC3 and ATAF subgroups under drought, cold, salt and ABA treatments.A total of 190 NACs were identified in tobacco, and the average length of amino acids was 347. The proteins were hydrophilic except NtabNAC190, and most of them were located in the nucleus according to Subcellular localization. Further, the proteins we classified into 18 subgroups, and expression pattern analysis showed that the expression specificity of different subgroups was different. 9 tobaccogenes in AtNAC3 and ATAF subgroupwere significantly up-regulated under abiotic stress treatment, whereas,andwere the most significant candidates.,andare involved in the regulation of adversity stress response, which may be good regulators to improve tobacco breeding in stress resistant.

L.; NAC gene family; transcription factors; phylogeny; expression pattern; abiotic stress

. Email：leibo_1981@163.com

余世洲，楊志曉，余婧，等. 普通煙草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族抗逆基因篩選與表達分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（2）.YU Shizhou, YANG Zhixiao, YU Jing, et al. Identification and expression analyses of the NAC transcription factor family in Nicotiana tabacum L. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0158

煙草基因組計劃重大專項（No. 110202001027（JY-10））；中國煙草總公司貴州省公司項目（2021XM05）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合基礎(chǔ)[2020]1Y106）

余世洲（1986—），博士，副研究員，主要從事數(shù)量遺傳學(xué)與生物信息學(xué)研究，Tel：0851-84116909，Email：yusz@nwafu.edu.cn

雷波（1981—），博士，研究員，主要從事煙草分子生物學(xué)研究，Tel：0851-84116909，Email：leibo_1981@163.com

2021-09-08；

2021-12-29