王云霞，張苗苗，謝志民

茵梔黃口服液是2019年國家評價性抽檢品種，具有清熱解毒，利濕退黃，用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見面目悉黃、胸肋脹痛等；由茵陳提取物12 g、梔子提取物6.4 g、黃芩苷40 g 和金銀花提取物8 g按照工藝制成1 000 mL，質量標準中制法項規(guī)定添加有0.3%的苯甲酸鈉作為防腐劑［1］，以防止茵梔黃口服液在儲存過程中發(fā)生霉變，2015 年版《中國藥典》（四部）通則0181 合劑［2］項下規(guī)定苯甲酸的用量不得超過0.3%，添加防腐劑過少起不到防腐作用，口服液在儲存過程中會變質，添加過量防腐劑，容易導致人體攝入防腐劑過多，會對人體造成一定危害，過量攝入苯甲酸和苯甲酸鈉，會造成肝毒性及腎毒性，有研究表明還會造成染色體分裂異常甚至致癌，故苯甲酸和苯甲酸鈉的過量攝食是不合適的［3］，這就必須嚴格控制工藝，嚴格控制處方中的加入量，防止少加，多加及亂加別的防腐劑，才能保證藥品的安全有效。

目前檢測防腐劑方法主要有高效液相色譜法［4-12］和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法［13］。高效液相色譜-質譜聯(lián)用法所用儀器較昂貴，不易普及，為了滿足普通實驗室的檢測需求，本實驗擬采用變換波長高效液相色譜法，篩選出6種防腐劑作為目標物，并對來自全國抽檢的32 批次茵梔黃口服液進行相關檢測，為茵梔黃口服液的安全性評價提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；SPD-M10AVP 二極管陣列檢測器（日本島津公司）；BT124S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 32 批次樣品均為國家評價性抽檢樣品，均來自于北京華潤高科天然藥物有限公司（獨家產品，最早生產批號2721247，生產日期是2017 年10 月；最晚生產批號181216，生產日期是2018年12月，1個規(guī)格：10毫升/支，服用劑量為一次10 mL）。

苯甲酸對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號100419-201703，含量99.9%）、山梨酸鉀對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號101075-201602，含量99.7%）、羥苯甲酯對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號100278-201705，含量100.0%）、羥苯乙酯對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號100847-201604，含量99.9%）、羥苯丙酯對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號100444-201804，含量99.6%）、羥苯丁酯對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號110792-200503，含量100.0%）；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液（B）（用磷酸調pH值3.7）（V/V），梯度洗脫（洗脫程序詳見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測器；苯甲酸以228 nm 為檢測波長，山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯及羥苯丁酯以255 nm 為檢測波長；進樣體積10μL。

表1 梯度洗脫順序

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取苯甲酸、山梨酸鉀、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯適量，分別加50% 甲醇制成240、80、10、10、10、10 mg/L的溶液，即得。

1.2.2.2 供試品溶液的制備精密吸取樣品1 mL，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.3 系統(tǒng)適用性試驗精密稱取山梨酸鉀對照品215.24 mg、羥苯甲酯對照品22.88 mg、羥苯乙酯對照品22.72 mg、羥苯丙酯對照品19.88 mg、羥苯丁酯20.88 mg，置同一50 mL 量筒中，加茵梔黃口服液（批號181206）使溶解至40 mL，搖勻，即得茵梔黃口服液模擬陽性樣品，精密吸取茵梔黃口服液模擬陽性樣品、茵梔黃口服液陰性樣品（未加防腐劑），分別按照“1.2.2.2”項下制備茵梔黃口服液模擬陽性樣品供試品溶液及茵梔黃口服液陰性樣品供試品溶液。精密吸取以上2 種溶液及“1.2.2.1”項下對照品溶液，按“1.2.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結果，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；苯甲酸的理論塔板數(shù)為20 655、山梨酸的理論塔板數(shù)為20 417、羥苯甲酯的理論塔板數(shù)為19 988、羥苯乙酯的理論塔板數(shù)為193 447、羥苯丙酯的理論塔板數(shù)為442 048、羥苯丁酯的理論塔板數(shù)為165 648；陰性無干擾；同時對生產批號2721247，生產日期為2017 年10月；生產批號272538，生產日期為2018年4月；生產批號272848，生產日期為2018 年6 月的三批次產品也做了加標模擬陽性試驗，目標峰與雜質峰均能很好分離且無干擾。以二極管陣列檢測器測定，茵梔黃口服液模擬陽性樣品中6種防腐劑色譜峰的紫外吸收圖譜與對照品溶液色譜峰的紫外吸收圖譜一致。結果見圖1。

圖1 茵梔黃口服液HPLC圖：A為對照品，B為模擬陽性樣品，C為陰性樣品

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性關系考察精密稱取羥苯甲酯對照品10.18 mg、羥苯乙酯對照品10.02 mg、羥苯丙酯對照品9.97 mg、羥苯丁酯對照品10.29 mg，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為對羥基苯甲酸酯類的對照品儲備溶液；精密稱取苯甲酸對照品12.35 mg、山梨酸鉀對照品16.14 mg，置同一25 mL 量瓶中，精密加入對羥基苯甲酸酯類的對照品儲備溶液10 mL，用50% 甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為6 號對照品溶液；精密吸取6 號對照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為5 號對照品溶液；精密吸取5 號對照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為4 號對照品溶液；精密吸取4 號對照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為3 號對照品溶液；精密吸取3號對照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為2號對照品溶液；精密吸取2號對照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為1 號對照品溶液；精密吸取1號對照品溶液5 mL，置10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為0號對照品溶液。吸取上述7種不同質量濃度溶液各10μL注入液相色譜儀，按“1.2.1”項下條件進行測定。以進樣質量（C，ng）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程和線性范圍見表2。

表2 標準曲線方程及線性范圍

1.2.4.2 精密度試驗精密吸取“1.2.4.1”項下1、3、6 號對照品溶液各10μL，按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，6 種防腐劑峰面積的RSD 均小于0.6 %（n=6），表明儀器精密度良好。

1.2.4.3 重復性試驗由本實驗室的兩名實驗員取“1.2.3”項下的茵梔黃口服液模擬陽性樣品在不同時間按照“1.2.2.2”項下方法制備供試液，用“1.2.4.1”項下3 號對照品溶液作為對照，用不同儀器按“1.2.1”項下條件進行測定，結果6 種防腐劑的含量的RSD 均小于0.90%（n=12），表明該方法的重復性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗精密吸取“1.2.4.3”項下茵梔黃口服液模擬陽性供試品溶液（第一次實驗員制備的供試液），放置0、2、4、8、12、16、20、24 h 后按“1.2.1”項下色譜條件進行測定。結果，6 種防腐劑峰面積的RSD 均小于0.6%（n=8），表明該樣品在24 h內有很好的穩(wěn)定性。

1.2.4.5 加樣回收率試驗精密稱取苯甲酸對照品62.85 mg、山梨酸鉀對照品91.64 mg、羥苯甲酯對照品14.13 mg、羥苯乙酯對照品13.08 mg、羥苯丙酯對照品12.48 mg、羥苯丁酯對照品15.37 mg，置同一50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為加樣對照品溶液。精密吸取重復性試驗項下的模擬陽性樣品1 mL，6 份，分別置100 mL 量瓶中，分別精密加入上述對照品溶液2 mL，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取“1.2.4.1”項下3 號對照品溶液作為對照，按“1.2.1”項下色譜條件進行測定，結果6種防腐劑平均加樣回收率分別為100.69%、98.44%、101.21%、104.18%、103.95%、103.55%，RSD 分別為0.24%、0.29%、0.72%、0.71%、0.44%、0.34%（n=6）結果見表3。

表3 6種防腐劑的回收率測定結果（n=6）

1.2.4.6 最低方法檢出限和定量限精密稱取羥苯甲酯對照品9.07 mg、羥苯乙酯對照品4.39 mg，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為1號儲備溶液；精密稱取羥苯丙酯對照品7.99 mg、羥苯丁酯對照品6.58 mg、山梨酸鉀對照品5.39 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為2號儲備溶液；精密稱取苯甲酸對照品8.04 mg，置50 mL量瓶中，精密加入1 號儲備溶液3 mL、2 號儲備溶液3 mL，加50%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為1 號加樣對照品溶液。精密量取1 號加樣對照品溶液1.5 mL，置5 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為2 號加樣對照品溶液。精密量取“1.2.3”項下模擬陰性樣品1 mL，4 份，分別置50 mL 量瓶中，分別精密加入上述1號對照品溶液0.7 mL、1.3 mL和2號對照品溶液0.7 mL、1.3 mL，各加50%甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為定量限和檢測限供試品溶液。按“1.2.1”項下色譜條件進行測定，按色譜峰峰高與基線噪聲的比值計算，基線噪音3 倍量峰高時的含量為最低檢出限、基線噪音10倍量峰高時的含量為最低定量限。結果苯甲酸的最低檢出限為0.600 ng，最低定量限為2.400 ng；山梨酸鉀的最低檢出限為0.015 ng，最低定量限為0.140 ng；羥苯甲酯的最低檢出限為0.025 ng，最低定量限為0.330 ng；羥苯乙酯的最低檢出限為0.090 ng，最低定量限為0.270 ng；羥苯丙酯的最低檢出限為0.010 ng，最低定量限為0.040 ng；羥苯丁酯的最低檢出限為0.022 ng，最低定量限為0.080 ng。

2 結果

對抽檢的32 批次茵梔黃口服液按照“1.2.2.2”項制備方法制備供試液，按照“1.2.2.1”項濃度配制對照品溶液濃度，按“1.2.1”項色譜條件進行測定，32批均檢出苯甲酸，含量范圍2.393 0～2.591 9 g/L，32批均未檢出其他5種防腐劑。對于苯甲酸限度的確定，根據(jù)2015 年版《中國藥典》（四部）通則0181合劑項下規(guī)定苯甲酸的用量不得超過0.3%，根據(jù)茵梔黃口服液處方及工藝，每1 000 毫升加苯甲酸鈉3 g，換算為苯甲酸2.54 g，按照工藝偏差±10%計算，暫擬定每1 mL 含苯甲酸鈉以苯甲酸計，應為2.29～2.79 mg。

3 討論

3.1 波長的確定在進行液相色譜法測定時，一般選取目標物的最大吸收波長來進行檢測，此時檢測靈敏度最高，但在多組分測定時單一波長很難滿足測定需求，故選用變換波長法。用二極管陣列檢測器通過全波長光譜掃描得出苯甲酸的最大吸收為228 nm，山梨酸的最大吸收為252 nm，羥苯甲酯的最大吸收為255 nm，羥苯乙酯的最大吸收為255 nm，羥苯丙酯的最大吸收為255 nm，羥苯丁酯的最大吸收為256 nm，除苯甲酸外，其余5種成分最大吸收波長差距不大，為了減少變換波長的頻次，并且對山梨酸檢測波長在252 nm 和255 nm、羥苯丁酯檢測波長在256 nm和255 nm下的峰面積進行比較，差異不大，最終進行組合，確定了6種防腐劑的最大吸收，確定了正文中的檢測波長。

3.2 色譜條件的確定在預試驗中，筆者分別選用了等度洗脫和梯度洗脫兩種類型進行試驗，等度流動相有甲醇-0.15%乙酸銨（20∶80，V/V）、甲醇-乙腈-0.15%乙酸銨（10∶5∶80，V/V/V），結果是基線較平，出峰過快，苯甲酸和山梨酸色譜峰不能完全分離，達不到改變波長的要求，目標物色譜峰出峰時間漂移。梯度洗脫程序①：流動相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH 值3.5），程序（V/V）0～30 min（A）20%→80%，（B）80%→20%，30～40 min

（A）80%，（B）20% ，梯度洗脫程序②：流動相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH 值3.5），程序（V/V）0～40 min（A）20%→80%，（B）80%→20%，40～50 min（A）80%，（B）20%，結果是山梨酸和羥苯甲酯的色譜峰完全重合，無法分析；梯度洗脫程序③：流動相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH 值3.7），程序（V/V）0～40 min（A）

20%→80%，（B）80%→20%，40～50 min（A）80%，（B）20%，結果對照色譜峰能夠完全分離，供試品色譜峰除羥苯乙酯色譜峰前后有干擾之外，其余均能完全分離，繼續(xù)在此基礎上調整流動相，在49～69 min 期間采用過流動相（A）由25%逐步升至50%、由25%逐步升至48%，色譜圖分離效果不如49～69 min（A）44%，（B）56% ，在系統(tǒng)適用性過程中采用在49～69 min（A）43%，（B）57%、（A）45%，（B）55%，均能達到分離效果，分析原因，4 號峰左右側雜質峰與4 號目標物極性相似，利用梯度洗脫改變了流動相配比，出峰速度不能達到恒速，故效果不如等度洗脫。最終確定梯度洗脫程序④：流動相（A）甲醇-（B）0.02 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH 值3.7），程序（V/V）0～48 min（A）25%，（B）75%，48～49 min（A）25%→44%，（B）75%→56%，49～69 min（A）44%，（B）56%，69～70 min（A）44%→54%，（B）56%→46%，70～102 min（A）54%，（B）46%，102～103 min（A）54%→90%，（B）46%→10%，103～113 min（A）90%，（B）10%，結果6 種防腐劑峰形對稱，無干擾，分離度好。與乙酸銨系列流動相比，優(yōu)勢在于流動相配置好后，流動相的pH 值不會發(fā)生變化，色譜峰的時間不會漂移，在配制流動項時需要注意的是0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液用磷酸調pH 值時，一定要準確用酸度計調至3.7，否則山梨酸和羥苯甲酯色譜峰會完全重合，在此條件下進行測定用三個廠家色譜柱試驗均能達到較好的分離效果。

3.3 小結茵梔黃口服液目前所執(zhí)行的標準無防腐劑檢測項，并且本品還會在新生兒黃疸中使用，考慮到安全性，故建議增加防腐劑檢查項。本實驗建立的方法，6 種防腐劑色譜峰的分離度較高，回收率平行性較好，最大優(yōu)點是正文中的流動相可以將目標峰與周圍雜質峰完全分離，避免造成假陽性結果，該方法可以為茵梔黃口服液中防腐劑的檢查提供一定的依據(jù)，也可以為其他口服液在防腐劑的檢查中提供一定的參考價值。