李瓊，王磊，高波

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由冠狀動脈急性持續(xù)缺血缺氧引起心肌壞死的心血管疾病，具有極高的致死率。目前，臨床主要采用溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋手術(shù)等手段恢復(fù)心肌血液供應(yīng)。然而，一旦心肌供血恢復(fù)，會引起心肌細胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞損傷和凋亡［1］。近年來，越來越多的數(shù)據(jù)表明，微小RNA（microRNA，miRNA）的表達失調(diào)與人類多種心血管疾病有關(guān)［2］，包括缺氧復(fù)氧損傷［3］。miR-204-5p位于人類染色體9q21.12，Xiao 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)下心肌細胞中miR-204-5p 表達下調(diào)，miR-204-5p 通過靶向自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ調(diào)控缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞自噬；此外，Qiu 等［5］研究表明，miR-204-5p 通過調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白1（Silencing regulatory protein 1，sirt1）介導(dǎo)的自噬，保護H9C2 細胞免受缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷。然而，miR-204-5p 對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)下的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響和機制仍有待闡明。本研究以心肌細胞缺氧復(fù)氧模型模擬AMI 過程，旨在闡明miR-204-5p 對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)下的心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，探索其分子機制，以期為臨床治療AMI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料大鼠胚胎心肌細胞株H9C2購于上海中科院典型培養(yǎng)物保藏細胞庫；MTT 試劑盒購于美國Sigma 公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Promega 公司；乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；PCR 引物、miR-con、miR-204-5p mimics、pcDNA、pcDNA-蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B（The protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）及WT-PTP1B 和MUT-PTP1B 的構(gòu)建和測序均由上海生工公司提供。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；Trizol 試劑和western 相關(guān)試劑購于上海碧云天公司；細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl相關(guān)X（Bax）等鼠源Ⅰ抗購于美國Santa Cruz公司；兔源PTP1B抗體購于Abcam公司；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購于武漢博士德公司；LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2 心肌細胞缺氧復(fù)氧模型的建立用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液）在37 ℃含5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2。將H9C2 細胞培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，復(fù)氧時更換為新鮮高糖DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)6 h，標記為缺氧復(fù)氧組；未經(jīng)任何處理的H9c2細胞標記為空白組。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組收集對數(shù)期的H9c2細胞，分別將miR-con、miR-204-5p mimics 轉(zhuǎn)染至H9c2細胞，轉(zhuǎn)染成功后按照“1.2.1”方法進行缺氧復(fù)氧處理，分別標記為缺氧復(fù)氧+miR-con 組、缺氧復(fù)氧+miR-204-5p 組。后續(xù)實驗中為進一步驗證miR-204-5p 是通過調(diào)控PTP1B 表達進而影響缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激，將miR-204-5p mimics 和pcDNA 共轉(zhuǎn)染至H9c2 細胞，進行缺氧復(fù)氧處理后標記為缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA 組；將miR-204-5p mimics 和pcDNA-PTP1B 共轉(zhuǎn)染至H9c2 細胞，進行缺氧復(fù)氧處理后標記為缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組。轉(zhuǎn)染方法參照LipofectamineTM2000使用說明書。

1.2.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（qRTPCR）檢測用Trizol 法提取H9C2 細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板制備qRT-PCR反應(yīng)體系，上實時熒光定量PCR 儀檢測miR-204-5p 和PTP1B mRNA的相對表達量。

1.2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?TargetScan 預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-204-5p 與PTP1B 序列的3’-UTR 存在結(jié)合位點。將含有結(jié)合位點的PTP1B3’-UTR 片段或cDNA插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建WT-PTP1B、MUTPTP1B。分別將WT-PTP1B、MUT-PTP1B 與miR-204-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至H9c2 細胞，收集轉(zhuǎn)染48 h細胞并測定各組細胞中熒光素酶活性。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測細胞增殖收集各組對數(shù)生長期H9c2細胞，細胞接種至96 孔板，每孔加入10μL 的MTT 試劑（5 g/L）孵育4 h，棄上清，向各孔內(nèi)加入150μL的DMSO，振蕩10 min，利用酶標儀檢測各孔490 nm 處吸光度值（OD），細胞存活率（%）=（處理組OD/對照組OD）×100%。

1.2.6 檢測LDH、cTnT、SOD、MDA、ROS 水平細胞分組處理后，收集細胞培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明檢測LDH、cTnT含量。同時收集各組H9C2細胞，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，低溫下12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測SOD、MDA、ROS水平。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡用1×binding buffer 重懸各組細胞調(diào)整其濃度為1×105個/毫升。取5μL的Annexin V/FITC 和10μL的PI溶液依次加入到100 μL 細胞懸液中，避光孵育15 min，補加1×binding buffer至500μL后，于1 h內(nèi)上機檢測。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測 RIPA裂解液提取細胞總蛋白，每組取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入各蛋白Ⅰ抗（1∶500 稀釋）及內(nèi)參β-actin 一抗（1∶1 000 稀釋），洗膜后，加入Ⅱ抗（1∶2 000），化學(xué)發(fā)光顯影，放入自動凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件測定各蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗；多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧處理后心肌細胞中miR-204-5p 和PTP1B 表達情況與空白組比較，缺氧復(fù)氧組心肌細胞miR-204-5p 表達降低，PTP1BmRNA 和PTP1B蛋白的表達升高（P＜0.05），見表1和圖1。

表1 缺氧復(fù)氧處理心肌細胞影響miR-204-5p和PTP1B表達/±s

表1 缺氧復(fù)氧處理心肌細胞影響miR-204-5p和PTP1B表達/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組t值P值重復(fù)次數(shù)99 miR-204-5p 1.00±0.09 0.21±0.04①24.06＜0.001 PTP1B mRNA 1.00±0.13 6.74±0.58①28.97＜0.001 PTP1B蛋白0.31±0.05 0.76±0.08①14.31＜0.001

圖1 檢測心肌細胞中PTP1B蛋白表達

2.2 miR-204-5p 靶向調(diào)控PTP1B 的表達 Targetscan 預(yù)測到miR-204-5p 與PTP1B 序列的3’UTR存在部分連續(xù)結(jié)合位點，見圖2A。當上調(diào)miR-204-5p 表達后，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PTP1B 的3’UTR 報告基因心肌細胞的熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染MUT-PTP1B 的3’UTR 報告基因心肌細胞的熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見表2。當上調(diào)miR-204-5p 表達后，心肌細胞中PTP1B 蛋白的表達顯著降低；當下調(diào)miR-204-5p 表達后，心肌細胞中PTP1B 蛋白的表達顯著增加（P＜0.05），見表3 和圖2B。提示PTP1B 是miR-204-5p 的靶基因，miR-204-5p可負性調(diào)控PTP1B的表達。

表2 雙熒光素酶報告實驗/±s

表2 雙熒光素酶報告實驗/±s

組別miR-con組miR-204-5p組t值P值重復(fù)次數(shù)99 WT-PTP1B 1.00±0.09 0.35±0.05 18.94＜0.001 MUT-PTP1B 1.46±0.12 1.52±0.15 0.94 0.363

表3 miR-204-5p靶向PTP1B調(diào)控其表達/±s

表3 miR-204-5p靶向PTP1B調(diào)控其表達/±s

注：①與miR-con組比較，P＜0.05。②與anti-miR-con組比較，P＜0.05。

組別miR-con組miR-204-5p組anti-miR-con組anti-miR-204-5p組F值P值重復(fù)次數(shù)9999 PTP1B蛋白0.31±0.04 0.06±0.03①0.29±0.05 0.45±0.06②109.22＜0.001

圖2 miR-204-5p靶向調(diào)控PTP1B的表達：A為PTP1B的3’UTR中含有與miR-204-5p互補的核苷酸序列；B為心肌細胞中PTP1B蛋白的表達

2.3 過表達PTP1B逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞增殖的影響與空白組相比，缺氧復(fù)氧處理顯著抑制心肌細胞的存活，促進PTP1B表達，抑制Cyclin D1 表達，促進LDH 和cTnT 的釋

放；與缺氧復(fù)氧+miR-con 組相比，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p 組心肌細胞存活率顯著升高，PTP1B 表達含量顯著降低，Cyclin D1 表達顯著升高；與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞存活率顯著降低，PTP1B表達和LDH 含量顯著升高，Cyclin D1 表達顯著降低，LDH 和cTnT 含量顯著升高（P＜0.05），見表4 和圖3。以上結(jié)果表明，缺氧復(fù)氧處理可顯著抑制心肌細胞存活，而miR-204-5p 通過下調(diào)PTP1B 表達促進心肌細胞存活。

圖3 檢測心肌細胞中Cyclin D1蛋白表達

表4 轉(zhuǎn)染miR-204-5p促進缺氧復(fù)氧處理心肌細胞存活率/±s

表4 轉(zhuǎn)染miR-204-5p促進缺氧復(fù)氧處理心肌細胞存活率/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復(fù)氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧+miR-con組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復(fù)次數(shù)999999 PTP1B 0.27±0.07 0.81±0.05①0.78±0.04 0.42±0.18②0.46±0.18 0.61±0.18③23.09＜0.001 Cyclin D1 0.75±0.06 0.34±0.03①0.31±0.04 0.56±0.06②0.61±0.05 0.38±0.04③120.43＜0.001 LDH/（U/L）480.76±36.96 895.91±51.84①850.83±62.11 629.63±54.59②657.84±56.76 721.85±55.49③72.98＜0.001 cTnT/（μg/L）0.26±0.04 0.73±0.08①0.75±0.09 0.42±0.05②0.44±0.06 0.63±0.08③72.16＜0.001細胞存活/%100.00±6.80 55.99±4.69①52.72±4.59 78.37±6.48②78.89±5.74 61.23±6.28③85.49＜0.001

2.4 過表達PTP1B逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響與空白組比較，缺氧復(fù)氧處理后心肌細胞ROS 水平顯著提高，SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高；與缺氧復(fù)氧+miR-con 組比較，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p 組心肌細胞SOD 活力顯著升高，ROS 水平顯著降低，MDA含量顯著降低；與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞SOD 活力降低，ROS 水平顯著提高，MDA 含量升高（P＜0.05），見表5。結(jié)果表明，缺氧復(fù)氧可誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷，miR-204-5p 通過下調(diào)PTP1B 表達則提高抗氧化物酶SOD的活力，降低MDA含量和細胞內(nèi)ROS水平，對心肌細胞具有保護作用。

表5 過表達PTP1B逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響/±s

表5 過表達PTP1B逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復(fù)氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧+miR-con組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復(fù)次數(shù)9 99999 SOD/（U/L）24.60±1.34 9.85±0.87①10.61±0.95 16.39±0.78②17.46±1.27 12.53±0.86③255.35＜0.001 ROS熒光強度486.53±75.69 1486.24±162.087①1557.26±156.86 789.57±93.62②726.75±86.45 1236.27±126.58③118.14＜0.001 MDA/（nmol/mL）4.83±0.35 15.73±1.18①15.35±1.78 7.84±0.85②8.13±1.09 12.21±1.32③127.54＜0.001

2.5 過表達PTP1B逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響與空白組比較，缺氧復(fù)氧處理顯著抑制心肌細胞Bcl-2蛋白表達，促進Bax 蛋白表達，促進心肌細胞凋亡；與缺氧復(fù)氧+miR-con 組比較，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p 組心肌細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率降低；與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA 組比較，缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B 組心肌細胞Bcl-2 蛋白表達顯著降低，Bax 蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率升高（P＜0.05），見表6 和圖4。以上結(jié)果表明，缺氧復(fù)氧處理可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，而miR-204-5p 通過下調(diào)PTP1B 表達可抑制缺氧復(fù)氧處理誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

表6 轉(zhuǎn)染miR-204-5p抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細胞凋亡/±s

表6 轉(zhuǎn)染miR-204-5p抑制缺氧復(fù)氧處理心肌細胞凋亡/±s

注：①與空白組向比較，P＜0.05。②與缺氧復(fù)氧+miR-con組向比較，P＜0.05。③與缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組向比較，P＜0.05。

組別空白組缺氧復(fù)氧組缺氧復(fù)氧+miR-con組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA組缺氧復(fù)氧+miR-204-5p+pcDNA-PTP1B組F值P值重復(fù)次數(shù)9 99999 Bcl-2蛋白0.67±0.05 0.14±0.03①0.18±0.03 0.45±0.05②0.40±0.04 0.22±0.03③237.52＜0.001 Bax蛋白0.21±0.04 0.85±0.06①0.89±0.07 0.34±0.03②0.41±0.04 0.57±0.06③256.77＜0.001細胞凋亡率/%5.57±0.72 23.26±1.82①22.81±1.44 13.66±1.35②12.59±0.96 18.38±1.16③249.22＜0.001

圖4 檢測心肌細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達

3 討論

AMI是臨床最常見的心血管疾病之一。心肌細胞損傷發(fā)生在缺血再灌注損傷后的心肌組織中，氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷時心肌損傷擴大的重要因素，在急性心肌梗死中起重要作用［6］。

近年來，miRNA 在心血管疾病中的作用引起研究者的興趣，包括miR-223-3p［7］和miR-210［8］在內(nèi)的許多miRNA 參與心肌細胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。此外，Li 等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-340-5p 通過調(diào)節(jié)Act1/NF-κB通路對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激具有保護作用。目前，對miR-204-5p 的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，其在心血管疾病中的作用并完全闡明。Koyama 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p 是醛固酮刺激心肌細胞中t 型鈣通道表達的必需基因；Yu等［11］研究表明，敲減lncRNA AK139328 通過調(diào)控miR-204-3p 表達，抑制心肌細胞自噬，可減輕糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷；此外，miR-204通過靶向LC3-Ⅱ?qū)θ毖俟嘧⒄T導(dǎo)的心肌細胞自噬具有抑制作用［4］。PTP1B 是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，廣泛存在于心臟組織中，與心血管疾病密切相關(guān)［12］。PTP1B的缺失通過調(diào)節(jié)細胞自噬可消除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心肌功能障礙［13］。PTP1B還是循環(huán)ADP 核糖體誘導(dǎo)心室肌細胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子［14］。此外，miR-135a 通過靶向PTP1B 對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用［15］。生物信息學(xué)分析顯示，PTP1B 是miR-204-5p 潛在靶基因，但miR-204-5p 能否介導(dǎo)PTP1B 表達調(diào)控缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激尚未可知。

本研究首先檢測了缺氧復(fù)氧處理的心肌細胞中miR-204-5p 和PTP1B 的表達，結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧處理可抑制miR-204-5p 表達，促進PTP1B 表達。進一步研究證實miR-204-5p 可靶向負性調(diào)控PTP1B 的表達，于是推測miR-204-5p 通過下調(diào)PTP1B參與對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的調(diào)控。當心肌損傷發(fā)生時，LDH和cTnT釋放將明顯增加，通過檢測細胞培養(yǎng)液LDH 和cTnT 的滲漏率能夠有效反映細胞損傷程度［16］。ROS 是引起氧化應(yīng)激的主要因子，氧化應(yīng)激引起細胞損傷，導(dǎo)致終產(chǎn)物MDA 的累積［17］。MDA 含量可以反映氧自由基攻擊引起的細胞膜損傷的嚴重程度［18］。研究人員發(fā)現(xiàn)，在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌損傷中ROS和MDA的水平升高，超氧化物歧化酶SOD 活性降低［19］。本研究中，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)后，心肌細胞存活率降低，細胞上清液中LDH 和cTnT 含量顯著升高，細胞內(nèi)MDA和ROS 水平顯著升高，而超氧化物歧化酶SOD 水平顯著降低，細胞凋亡率增加；而上調(diào)miR-204-5p 可以促進心肌細胞存活，抑制LDH 和cTnT 的釋放，抑制細胞內(nèi)MDA 和ROS 水平，增加SOD 水平，抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)過表達PTP1B 可部分逆轉(zhuǎn)miR-204-5p 對心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。這些結(jié)果表明，miR-204-5p 通過靶向PTP1B 表達能夠保護心肌細胞免受缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞凋亡和氧化應(yīng)激。