孔 曉, 王英俊, 吳瑩瑩, 劉 童, 宋愛環(huán), 唐學(xué)璽, 劉洪軍, 4

基于耳石形態(tài)的大瀧六線魚()群體判別研究

孔 曉1, 王英俊2, 3, 吳瑩瑩2, 3, 劉 童2, 3, 宋愛環(huán)2, 3, 唐學(xué)璽1, 劉洪軍2, 3, 4

(1. 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 山東省海洋科學(xué)研究院, 山東 青島 266104; 3. 青島市海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘與利用工程實驗室, 山東 青島 266104; 4. 青島市水產(chǎn)生物品質(zhì)評價與利用工程研究中心，山東 青島 266104)

為探究鄰近海域大瀧六線魚()群體間的判別問題, 共采集中國黃、渤海近岸海域7個野生群體(連云港、青島、威海、煙臺、秦皇島、大連、丹東)和1個養(yǎng)殖群體(威海)的大瀧六線魚共183尾, 利用傳統(tǒng)形態(tài)測量法和傅里葉分析對不同群體耳石形態(tài)進行多元統(tǒng)計分析。典型判別分析結(jié)果顯示, 傳統(tǒng)形態(tài)測量法選擇8個參數(shù)值用于判別分析, 傅里葉分析法選擇12個系數(shù)(elliptic Fourier descriptors, EFDs)用于判別分析, 綜合判別成功率為79.2%。聚類分析顯示, 威海養(yǎng)殖群體在最外層, 與野生群體距離較遠, 與判別散點圖結(jié)果一致。丹東、青島野生群體自成一支, 與其他群體距離較遠, 可被認定為獨立的生態(tài)群體, 推測環(huán)境因素是導(dǎo)致不同群體間耳石差異的主要原因。

耳石形態(tài); 大瀧六線魚; 群體判別; 傅里葉分析

大瀧六線魚(), 別名歐式六線魚、六線魚等, 屬鲉形目(Scorpaeniformes)、六線魚科(Hexagrammidae), 俗稱“黃魚”, 主要分布于中國渤海、黃海、東海, 也見于朝鮮半島、日本及俄羅斯遠東諸海[1-3]。大瀧六線魚是近海冷溫性戀礁魚類, 其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富, 是我國北方重要的經(jīng)濟魚種, 素有“北方石斑”之稱。近年來, 由于過度捕撈和海洋生態(tài)環(huán)境污染, 大瀧六線魚資源已現(xiàn)衰退之勢, 且存在養(yǎng)殖及增殖放流群體種質(zhì)資源來源混雜、群體追溯研究不足等一系列問題[4]。制定大瀧六線魚種質(zhì)資源保護和漁業(yè)管理條例, 需要清晰地把握其種群結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用大瀧六線魚樣本分別采自7個野生群體(連云港、青島、威海、煙臺、秦皇島、大連、丹東)和1個養(yǎng)殖群體(威海養(yǎng)殖群體), 魚體樣本在實驗室解凍后進行生物學(xué)測量, 測量體長(精確到1 mm)、體質(zhì)量(精確到0.01 g), 并摘取耳石。樣本采集地點、數(shù)量和體長等信息見表1。用超純水清洗耳石, 除去耳石外組織和黏液, 晾干后利用電子天平(分度值0.01 mg)進行稱重, 放入0.001 5 L離心管編號保存。

表1 大瀧六線魚的采樣資料

1.2 耳石形態(tài)學(xué)指標

本研究中左右矢耳石形態(tài)差異不明顯, 因此統(tǒng)一選取大瀧六線魚左側(cè)矢耳石作為研究對象, 個別左耳石缺失時使用右耳石代替。耳石形態(tài)分析中采用OLYMPUS SZ61體視顯微鏡對耳石進行拍照并采集圖像(圖1), 使用生物圖像處理軟件Image- proplus6.0對耳石形態(tài)學(xué)指標進行測量。實驗中使用的形態(tài)學(xué)參數(shù)包括: 耳石長(otolith length)、耳石寬(otolith width)、周長(perimeter)、面積(area)、最大半徑(radius max)、最小半徑(radius min)、半徑比(radius radio)、平均直徑(diameter mean)、耳石外切矩形長(size length)、外切矩形寬(size width) 10個形態(tài)測量指標, 3個形狀指數(shù)矩形趨近率(area/box)、橢圓率(aspect)、面密度(surface density)及耳石重(otolith weight)共14個參數(shù)。傳統(tǒng)形態(tài)參數(shù)的部分測量標準示意圖如圖2所示。

耳石長(otolith length)、耳石寬(otolith width)分別指耳石前端到后端的長度、背部到腹部的長度。

周長(perimeter)為耳石二維輪廓形狀的總長度。

面積(area)為耳石的二維投影面積。

最大半徑(radius max)、最小半徑(radius min)是指通過耳石幾何中心的最長半徑長度和最短半徑長度, 半徑比(radius radio)是耳石最大半徑和最小半徑之比。

平均直徑(diameter mean)是指過耳石幾何中心的直徑的平均長度。

外切矩形長(size length)、外切矩形寬(size width)分別指沿耳石長軸的最大費雷特(feret)直徑和最小費雷特(feret)直徑。

矩形趨近率(area/box)是指耳石面積與其外切矩形面積之比。

橢圓率(aspect)是指耳石外圍橢圓長徑與短徑之比。

面密度(surface density)代替耳石厚度, 計算方法為耳石質(zhì)量除以耳石面積。

圖1 大瀧六線魚左矢耳石內(nèi)側(cè)面示意圖

圖2 耳石測量標準的示意圖

1.3 傅里葉分析

傅里葉分析對耳石的二維圖像進行灰階轉(zhuǎn)換、二值化、消噪處理, 讀取圖像輪廓數(shù)據(jù)(圖3)。通過分析耳石二維輪廓的數(shù)學(xué)表達式系數(shù), 對耳石的輪廓曲線進行研究。使用SHAPE1.3軟件包對耳石圖像進行傅里葉轉(zhuǎn)換, 將耳石的輪廓曲線分解成個傅里葉系數(shù)(elliptic Fourier descriptors, EFDs)[13], 得到的系數(shù)越多越接近耳石原始輪廓。一般認為, 前20個系數(shù)(1—20)可較好地描述耳石外型輪廓信息。

圖3 傅里葉分析讀取耳石輪廓示意圖

1.4 數(shù)據(jù)分析

將形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)與提取的前20組傅里葉諧值結(jié)合進行數(shù)據(jù)分析。為提高傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)的有效性, 采用耳石長(otolith length)、耳石寬(otolith width)、周長(perimeter)、面積(area)、最大半徑(radius max)、最小半徑(radius min)、半徑比(radius radio)、外切矩形長(size length)、外切矩形寬(size width)與平均直徑(diameter mean)比值用于數(shù)據(jù)分析。以體長作為協(xié)變量, 對7個野生群體和1個養(yǎng)殖群體左矢耳石的13個形態(tài)測量參數(shù)和20個傅里葉系數(shù)進行多因素分析, 并進行正態(tài)性和方差齊性檢驗, 對不符合方差齊性的變量(<0.05)進行剔除, 將符合方差齊性的變量用于判別分析, 對各群體變量的平均值進行聚類分析。判別分析采用典型判別法(CDA), 聚類分析采用歐氏距離系統(tǒng)聚類法, 數(shù)據(jù)分析利用SPSS23.0和Excel2016軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 多因素方差分析

多因素方差分析結(jié)果顯示, 耳石長(otolith length)、耳石寬(otolith width)、周長(perimeter)、最大半徑(radius max)、最小半徑(radius min)、半徑比(radius radio)、外切矩形長(size length)、外切矩形寬(size width)、矩形趨近率(area/box)、橢圓率(aspect)、面密度(surface density)、耳石重(otolith weight)顯示出群體間差異(<0.05), 面積(area)在群體間未體現(xiàn)出差異。3、6、9、13、20在各群體間未表現(xiàn)出差異,2、5、8、10、15、16在各群體間差異顯著(<0.05)(表2)。

2.2 判別分析

對耳石形態(tài)數(shù)據(jù)進行典型判別分析, 只有經(jīng)過標準化的變量才可以用于判別分析。耳石的形態(tài)參數(shù)僅有8個指標耳石長、耳石寬、最大半徑、周長、面積、外切矩形長、外切矩形寬、橢圓率被納入判別分析, 傅里葉系數(shù)有12個指標(2、3、4、5、6、8、9、12、13、16、18、20)被納入判別分析?？傮w判別成功率為79.2%, 高于單獨的傳統(tǒng)形態(tài)測量法的判別成功率65.0%和傅里葉分析的判別成功率51.4%(表3)。其中威海養(yǎng)殖群體判別成功率最高, 為91.7%; 秦皇島群體判別成功率最低, 為69.2%, 連云港群體有較多的誤判分類發(fā)生在煙臺和威海群體之間(表3)。

從判別分析散點圖中各群體的組質(zhì)心可見, 威海養(yǎng)殖群體和其他7個野生群體區(qū)分明顯, 連云港群體和威海、煙臺群體之間有不同程度的混合, 與青島、大連、丹東群體之間區(qū)分明顯。青島和大連的群體距離較近, 秦皇島、大連、丹東群體混群程度較明顯(圖4)。

表3 大瀧六線魚8個群體耳石形態(tài)分析的判別結(jié)果

圖4 大瀧六線魚8個群體典型判別分析散點圖

Fig. 4 Scatter plot of canonical discriminant scores for 8 populations of Hexagrammos otakii

2.3 聚類分析

對7個野生群體和1個養(yǎng)殖群體大瀧六線魚耳石形態(tài)參數(shù)的平均值進行系統(tǒng)聚類分析。樹狀圖結(jié)果顯示, 秦皇島和大連群體距離最近, 首先聚為一小類, 然后與煙臺群體聚合, 形成第二小類。連云港和威海群體聚合在一起, 與第二小類聚合形成第三小類, 丹東群體、青島群體、威海養(yǎng)殖群體單獨形成一類(圖5)。

3 討論

3.1 耳石形態(tài)參數(shù)的確定和數(shù)據(jù)處理方法

耳石形態(tài)參數(shù)大致可以分為大小變量和輪廓變量2類。大小變量是通過線性測量軟件獲得耳石的表征性參數(shù)(如耳石的長、寬、周長、面積等), 耳石形狀指數(shù)由上述測量參數(shù)經(jīng)過數(shù)學(xué)公式轉(zhuǎn)換而來或通過測量軟件獲取數(shù)據(jù)[14-16]。另一類輪廓變量則側(cè)重于耳石的整體形態(tài)[17-18]。本文采用傳統(tǒng)形態(tài)測量法和傅里葉分析相結(jié)合對不同群體大瀧六線魚進行判別, 最終傳統(tǒng)形態(tài)測量法選取了橢圓率、外切矩形長、外切矩形寬、最大半徑、耳石周長、耳石長、耳石寬、耳石面積8個測量參數(shù)用于判別分析。傅里葉分析是對于提取的輪廓系數(shù)選取了前20個(1—20)用于描述耳石外部輪廓特征[19], 并最終選取了12個系數(shù)用于判別分析。一般來說, 低諧值的傅里葉系數(shù)表征物體的一般形狀, 高諧值的傅里葉系數(shù)可以表征輪廓邊緣中細微的不易被捕捉的形態(tài)變化[20-21]。在本研究中, 單獨使用耳石傳統(tǒng)形態(tài)分析的判別率為65.0%, 高于單獨使用傅里葉分析的判別率51.4%(表3)。以體長作為協(xié)變量對形態(tài)測量參數(shù)和20個傅里葉系數(shù)進行多重比較, 結(jié)果顯示8個群體間的形態(tài)變量值存在較大差異, 而傅里葉系數(shù)3、6、9、13、20在各群體間未檢測到差異, 導(dǎo)致單獨使用傅里葉分析的判別成功率低于傳統(tǒng)形態(tài)測量法。而使用兩種方法結(jié)合進行群體判別比單獨使用其中任何一種的判別成功率都要高, 說明使用形態(tài)測量法和傅里葉分析結(jié)合的方法進行群體判別的可靠性。相關(guān)研究中也選擇使用兩種變量結(jié)合來表征耳石形態(tài)和群體識別研究[22-24], 均取得較高的判別成功率。

圖5 大瀧六線魚群體聚類結(jié)果

3.2 耳石形態(tài)差異比較與原因探討

魚類耳石雖體積微小但形態(tài)變化多樣, 耳石邊緣具齒狀或不規(guī)則突起, 傳統(tǒng)形態(tài)測量法難以解釋這些細微變化。判別結(jié)果顯示, 黃渤海7個野生群體和1個養(yǎng)殖群體大瀧六線魚耳石整體形態(tài)差異較明顯, 綜合判別成功率較高, 為79.2%, 高于鳳鱭(70.4%)、刀鱭(68.3%)、短頜鱭(54.3%)等鱭屬魚類耳石的判別成功率[25-26], 原因在于大瀧六線魚耳石呈靴型, 基葉、翼葉區(qū)分明顯, 而鱭屬魚類耳石多呈近圓形, 并且基葉、翼葉的區(qū)分度弱于大瀧六線魚, 導(dǎo)致大瀧六線魚耳石在形態(tài)識別上更有優(yōu)勢。

在威海養(yǎng)殖群體和野生群體的傳統(tǒng)形態(tài)分析判別中, 有1個野生群體被誤判到養(yǎng)殖群體, 判別成功率為97.4%。傅里葉分析未出現(xiàn)誤判情況, 判別成功率為100%。兩種方法結(jié)合, 對威海野生群體和養(yǎng)殖群體總的判別成功率為100%。在判別分析散點圖中, 函數(shù)2可以區(qū)分養(yǎng)殖群體和其他野生群體。有研究表明同一種群的養(yǎng)殖和野生群體在不同環(huán)境下會表現(xiàn)出不同的耳石形狀[27-28]。本研究也證實同一物種的養(yǎng)殖群體和野生群體的耳石形狀存在差別。因此, 傳統(tǒng)形態(tài)測量法和傅里葉分析結(jié)合的耳石形態(tài)分析方法可有效地區(qū)分養(yǎng)殖群體和野生群體。

綜合判別結(jié)果顯示, 威海養(yǎng)殖群體的判別成功率最高, 為91.7%。丹東、青島、煙臺野生群體的判別成功率均大于80%, 其中丹東群體判別率達到88.2%, 青島群體為86.7%, 煙臺群體為85.7%, 均較高。秦皇島、大連、威海、連云港野生群體判別率為70%～80%, 可見丹東、青島、煙臺群體與其他野生群體混群度較低, 而其余4個野生群體間個體交流較多, 表現(xiàn)為多群體混棲特點。聚類分析表明威海養(yǎng)殖群體位于系統(tǒng)樹的最外層, 表明養(yǎng)殖群體與野生群體差異較大。丹東、青島群體自成一支, 與其他群體距離較遠, 可被認定為獨立的生態(tài)群體。秦皇島和大連群體, 連云港和威海野生群體距離較近, 差異較小, 這種聚類結(jié)果與其地理分布具有一定的關(guān)系。一般來說, 群體間地理位置距離較遠, 耳石的形態(tài)差異越明顯。連云港和威海野生群體差異較小的原因可能是由于黃海沿岸流導(dǎo)致兩地理群體間的個體混合。

魚類耳石的形態(tài)與魚類生活環(huán)境關(guān)系密切, 不同群體的耳石生長沉積過程可能會有差異。一些關(guān)于環(huán)境因素作用于魚類耳石的研究證實, 溫度、鹽度、深度、攝食條件、底質(zhì)類型等環(huán)境因子影響魚體的生理活動和新陳代謝[28-29], 從而影響耳石形狀[30-32]。胡發(fā)文等[33]發(fā)現(xiàn), 溫度、鹽度等環(huán)境因子對大瀧六線魚幼魚的呼吸及代謝等生理活動有顯著影響。耳石的形成發(fā)育受到魚體生理活動的調(diào)控, 因此環(huán)境因子在不同群體大瀧六線魚耳石形態(tài)差異方面有顯著影響。較遠的地理隔離是導(dǎo)致群體隔離的原因, 例如, 較多的誤判分類發(fā)生在地理位置相近的威海和煙臺群體之間, 樣本重疊的原因可能是誤判的群體之間有相似的環(huán)境壓力, 這與其地理位置相似。因此推測耳石形狀的群間變異中起主導(dǎo)作用的是環(huán)境因素而不是遺傳差異。國內(nèi)學(xué)者通過分子標記對大瀧六線魚群體進行多樣性研究, 用于揭示大瀧六線魚群體間遺傳結(jié)構(gòu)和變異演化。李瑩等[34]對6個大瀧六線魚群體線粒體控制區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn), 研究區(qū)域根據(jù)遺傳距離可以被劃分成山東和遼寧兩個地區(qū), 二者來源于不同的母系祖先。沈朕等[35]通過Cyt和-片段對我國近海大瀧六線魚分析顯示野生群體的遺傳多樣性明顯高于養(yǎng)殖群體。趙文溪等[36]通過和Cyt對黃海近海和離岸大瀧六線魚群體進行研究, 發(fā)現(xiàn)各群體間遺傳分化不明顯?？赡苁怯捎邳S東海沿岸流和暖流以及大瀧六線魚增殖放流行為的影響導(dǎo)致不同地區(qū)基因交流機會較多, 群體間遺傳差異不顯著。武世雄等[37]通過微衛(wèi)星分析認為不同地理群體間大瀧六線魚由于地理環(huán)境等因素導(dǎo)致交流減少。綜上所述, 不同種屬間耳石形態(tài)的差異主要由遺傳因素控制, 而同一物種不同群體間耳石形態(tài)的差異主要由生活習(xí)性、生理活動和環(huán)境因子等控制, 遺傳因素占次要原因。

耳石形狀分析可以獲得與遺傳研究相補充的信息, 用于研究具有遺傳同質(zhì)性的多群體樣本。采用多元統(tǒng)計分析的方法, 對中國黃、渤海近岸海域大瀧六線魚群體的耳石形態(tài)差異進行比較研究。結(jié)果表明養(yǎng)殖群體與野生群體差異顯著, 丹東和青島野生群體與其他群體間交流較少, 群體相對獨立。研究結(jié)果為大瀧六線魚群體結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源保護及管理提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。在今后的研究中, 可結(jié)合耳石聽溝形態(tài)的地標點法分析, 對耳石形態(tài)變化進行可視化圖形處理[38-39], 完善耳石形態(tài)學(xué)分析方法。

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Stock discriminations ofbased on otolith morphology

KONG Xiao1, WANG Ying-jun2, 3, WU Ying-ying2, 3, LIU Tong2, 3, SONG Ai-huan2, 3, TANG Xue-xi1, LIU Hong-jun2, 3, 4

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Marine Science Research Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, China; 3. Engineering Laboratory for Exploration and Utilization of Marine Germplasm Resources of Qingdao, Qingdao 266104, China; 4. Municipal Engineering Research Center of Aquatic Biological Quality Evaluation and Application, Qingdao 266104, China)

In order to identifystocks in adjacent waters, a total of 183individuals are investigated from 7 wild populations (Lianyungang, Qingdao, Weihai, Yantai, Qinhuangdao, Dalian, Dandong) and 1 reared population (Weihai) in the coastal waters of the Yellow and Bohai Seas of China, multivariate statistical analysis of otolith morphology in different groups using traditional morphometry and Fourier analysis. Canonical discriminant analysis results show that 8 variables of traditional measurement entered in the CDA, 9 harmonics EFDs entered in CDA with Fourier analysis, and the total correct classification is 79.2%. Phylogenetic analysis shows that the Weihai cultured population cluster in the outermost layer, and has the greatest difference with the wild populations, consistent with the discriminant scatter plot results. The Qingdao and Dandong wild populations are self-contained, distance from other groups and can be regarded as independent ecological communities. It is speculated that environmental factors are the main reasons for the differences in otolith among different populations.

otolith morphology;; stock discrimination; Fourier analysis

Jun. 24, 2021

Q149

A

1000-3096(2022)04-0034-10

10.11759/hykx20210624002

2021-06-24;

2021-09-14

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目(2019LZGC020); 山東省重點研發(fā)計劃(2021LZGC027); 中海油公益基金會項目“山東省典型海岸帶生物資源與生態(tài)環(huán)境保護修復(fù)研究”; 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(SD2019YY007)

[Agricultural Improved Seed Project of Shandong Province, No. 2019LZGC020; Key Research and Development Project of Shandong Province, No. 2021LZGC027; CNOOC Public Welfare Foundation Project; Agricultural Major Applied Technology Innovation Project of Shandong Province, No. SD2019YY007]

孔曉(1996—), 女, 山東德州人, 碩士研究生, 研究方向: 海洋生態(tài)學(xué), E-mail: kongxiao1220@163.com; 劉洪軍(1964—),通信作者, 男, 山東博興人, 研究員, 主要從事水產(chǎn)增養(yǎng)殖、漁業(yè)資源修復(fù)與海洋生態(tài)環(huán)境調(diào)控技術(shù)研究, E-mail: HongjunL@126.com

(本文編輯: 叢培秀)