■王 颯 郭曉軍，2 李 佳，2 宋 卓 王世英，2 朱寶成，2 王 偉，2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省飼用微生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

微生物發(fā)酵飼料是畜牧養(yǎng)殖業(yè)常用的飼料，通過(guò)添加微生物菌劑，不僅能保留飼料原料本身的營(yíng)養(yǎng)，還具有很好的抗菌效果，發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加，也是較好的抗生素替代品。微生物發(fā)酵飼料常用微生物菌種包括芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等[1-2]，不同菌種在發(fā)酵過(guò)程中作用不同。芽孢桿菌抗逆性強(qiáng)，能抑制好氧有害菌生長(zhǎng)，促進(jìn)厭氧有益菌增殖，能耐受胃酸和膽鹽，產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種消化酶，降解大分子物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝，芽孢桿菌常用菌種為枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌[3-4]。酵母菌富含豐富的蛋白酶，可以通過(guò)蛋白酶降解蛋白質(zhì)提高酸溶蛋白含量，并且可以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)[5-6]。乳酸菌可以通過(guò)菌群將蛋白質(zhì)水解成氨基酸和多肽，增加發(fā)酵體系中氨基酸和多肽含量，促進(jìn)動(dòng)物消化吸收[7]。

微生物發(fā)酵飼料能改善飼料的適口性[8]、促進(jìn)動(dòng)物分泌多種消化酶[9]、消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[10]、增加生物活性因子[11]、產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)[12]、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的體外消化率[13]、維護(hù)腸道菌群平衡并且提高經(jīng)濟(jì)效益[14]。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵飼料，不但具有良好的應(yīng)用價(jià)值，而且在代替抗生素方面有現(xiàn)實(shí)意義。

近些年來(lái)，對(duì)微生物發(fā)酵飼料的研究越來(lái)越深入。目前，通常采用單菌株或幾種互不拮抗的菌種復(fù)配成菌劑進(jìn)行發(fā)酵。Shi等[15]采用枯草芽孢桿菌和屎腸球菌發(fā)酵玉米-豆粕混合飼料，對(duì)照組為同條件下自然發(fā)酵，結(jié)果表明乳酸菌是發(fā)酵過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，其產(chǎn)生大量乳酸從而降低物料pH，試驗(yàn)組大豆抗原蛋白含量顯著降低，酸溶蛋白、小肽和游離氨基酸含量提高了6.5倍。史路路等[16]在玉米蛋白粉中添加酵母菌進(jìn)行優(yōu)化發(fā)酵，發(fā)酵后粗蛋白含量提高了20.04%，氨基酸和可溶性小肽也顯著增加。Wang等[17]用芽孢桿菌和乳酸桿菌共同發(fā)酵構(gòu)樹(shù)葉，顯著降低了纖維素含量，提高了小肽和必需氨基酸含量，提供了大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。Hao等[18]采用枯草芽孢桿菌和戊糖片球菌復(fù)合發(fā)酵混合物料（20%玉米、20%豆粕、48%麩皮和12%大豆皮），結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)發(fā)酵能有效降解復(fù)合飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料酸溶蛋白水平。

本試驗(yàn)室前期已篩選了多株具有產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和產(chǎn)抗菌物質(zhì)等功能的菌株，發(fā)酵后可明顯提高配合飼料的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和品質(zhì)。試驗(yàn)以單菌株及其復(fù)配菌劑分別發(fā)酵配合飼料，以pH、酸溶蛋白/粗蛋白、抗原蛋白和抑菌活性為主要檢測(cè)指標(biāo)，分析功能單菌株及其復(fù)合菌劑的發(fā)酵效果，研究菌株對(duì)發(fā)酵飼料產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分的影響，為豐富發(fā)酵菌種提供相應(yīng)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌FM-18、枯草芽孢桿菌FM-20和釀酒酵母JM-1均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 儀器

樣品粉碎機(jī)（PW 177），天津泰斯特儀器有限公司；pH計(jì)（ST 3100），奧豪斯儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4J），金壇市杰瑞爾有限公司；離心機(jī)（TG 20 M），長(zhǎng)沙市高新區(qū)麓谷國(guó)際工業(yè)園；分析天平（EN 1480 e=10d），民橋精密科學(xué)儀器公司；自動(dòng)凱氏定氮儀（K 9840），濟(jì)南海能儀器有限公司；電泳儀（BIO-RAD），美國(guó)伯樂(lè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)單菌株發(fā)酵體系和1個(gè)復(fù)合菌劑發(fā)酵體系，均以60%玉米粉、25%豆粕和15%麩皮為原料，設(shè)置含水量為40%。單菌株FM-18、FM-20、JM-1 3 種發(fā)酵體系均按其菌株活菌數(shù)1.0×109CFU/kg（干物質(zhì)）加入到原料中；3 種單菌株活菌數(shù)以FM-18：FM-20：JM-1=1：2：2 為比例配制成復(fù)合菌劑，再按1.0×109CFU/kg（干物質(zhì)）加入到原料中，4 種發(fā)酵體系均在37 ℃下發(fā)酵14 d。發(fā)酵過(guò)程中采用五點(diǎn)法每隔2 d取樣1次，每個(gè)發(fā)酵取樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)分析方法

1.4.1 物料pH測(cè)定

稱取發(fā)酵樣品10 g（精確至0.001 g）于90 mL 無(wú)菌水中，220 r/min 振蕩搖勻1 h，采用pH 計(jì)測(cè)定上清液的pH。

1.4.2 酸溶蛋白含量的測(cè)定

取烘干后的樣品0.5 g（精確至0.001 g）加入消煮管中，采用凱氏定氮法測(cè)定飼料中粗蛋白含量。具體測(cè)定方法詳見(jiàn)GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定》。

取新鮮樣品3 g（精確至0.001 g），加25 mL 15%三氯乙酸浸提4 h，10 000 r/min 離心5 min，取5 mL上清液于消煮管中，采用凱氏定氮法測(cè)定飼料中酸溶蛋白含量。具體測(cè)定方法詳見(jiàn)NY/T 3801—2020《飼料原料中酸溶蛋白的測(cè)定》。

式中：A0——粗蛋白中含有的酸溶蛋白含量（%）；

A1——酸溶蛋白含量（%）；

A2——粗蛋白含量（%）。

1.4.3 SDS-PAGE凝膠電泳法檢測(cè)抗原蛋白

將發(fā)酵飼料研磨，過(guò)60 目篩，取100 mg 加2 mL Tris-HCl（pH 8.8），漩渦振蕩，10 000 r/min離心5 min，上清液與上樣緩沖液按4：1比例混合，沸水浴10 min，10 000 r/min離心5 min，待測(cè)。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，備用。

取10 μL待測(cè)樣品和5 μL Maker分別進(jìn)行點(diǎn)樣，分離膠電壓為90 V，濃縮膠電壓調(diào)為120 V?？捡R斯亮藍(lán)R 250法染色，并用脫色液（甲醇：水：冰乙酸=9：9：1）洗脫至條帶清晰。

1.4.4 抑菌活性

稱取40 g（精確至0.001 g）發(fā)酵飼料于250 mL三角瓶中，加70 mL 甲醇[19]，混勻浸提2 h 后用4 層紗布過(guò)濾，4 ℃保存。在已制備好的大腸桿菌和沙門氏菌病原菌平板上打孔，每孔中加入100 μL浸提液，37 ℃培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑并記錄。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果用Excel 2019、SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中pH變化（見(jiàn)圖1）

圖1 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中pH變化

微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，pH 降低的速度和程度可反映發(fā)酵過(guò)程中乙酸、乳酸等脂肪酸的產(chǎn)生情況。同時(shí)，低pH 可以抑制大部分病原菌的增長(zhǎng)[20]，因此，pH常作為評(píng)價(jià)飼料發(fā)酵品質(zhì)的指標(biāo)之一。功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中pH變化見(jiàn)圖1所示。

由圖1 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，各發(fā)酵體系pH總體都呈下降趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵到第2天時(shí)，F(xiàn)M-20菌株發(fā)酵體系中pH 下降至4.37，說(shuō)明FM-20 菌株發(fā)酵中產(chǎn)生了多種酸性物質(zhì)；下降幅度從大到小依次為：FM-20>復(fù)合菌劑>JM-1>FM-18，下降幅度差異顯著（P<0.05）。當(dāng)發(fā)酵第14 天時(shí)，不同發(fā)酵體系的pH 差異不顯著（P>0.05）。

2.2 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中酸溶蛋白含量變化（見(jiàn)圖2）

粗蛋白含量是評(píng)價(jià)飼料質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了飼料中蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)水平。酸溶蛋白包括肽和游離氨基酸，飼料經(jīng)過(guò)發(fā)酵后大分子蛋白質(zhì)被降解為容易被吸收的氨基酸和小肽，因此酸溶蛋白在一定程度上反映了小肽含量[21]。各功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中酸溶蛋白含量變化見(jiàn)圖2所示。

由圖2可看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酸溶蛋白含量都呈先快速上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，但在發(fā)酵過(guò)程中含量有差異。4種發(fā)酵體系中復(fù)合菌劑體系酸溶蛋白含量最高能達(dá)到35.98%，單菌株發(fā)酵體系相對(duì)較低。發(fā)酵前期（0-6 d），復(fù)合菌劑發(fā)酵體系酸溶蛋白含量低于單菌株體系，與單菌株相比差異顯著（P<0.05），發(fā)酵后期（8-14 d），菌株間進(jìn)行協(xié)同提高了復(fù)合菌劑發(fā)酵體系酸溶蛋白含量，發(fā)酵第14天時(shí)與單菌株相比差異不顯著（P>0.05）。

圖2 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵過(guò)程中酸溶蛋白含量變化

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)不同發(fā)酵體系的飼料蛋白質(zhì)的分子量（見(jiàn)圖3）

飼料中豆粕作為主要的蛋白質(zhì)來(lái)源，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，影響動(dòng)物的消化吸收[22]。通過(guò)檢測(cè)原料和4種發(fā)酵體系發(fā)酵14 d后的產(chǎn)物，探究發(fā)酵飼料中大分子蛋白的降解情況。不同發(fā)酵體系蛋白的SDSPAGE檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同處理飼料的SDS-PAGE圖

飼料中含有的大分子蛋白難于消化，尤其是β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白免疫原性強(qiáng)，是引起幼齡動(dòng)物出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的主要因素。β-伴大豆球蛋白包括3 個(gè)亞基，分別是α亞基（分子質(zhì)量76 ku）、α'亞基（分子質(zhì)量72 ku）和β亞基（分子質(zhì)量52～54 ku）；大豆球蛋白包括兩個(gè)亞基，分別是酸性亞基A（分子質(zhì)量35 ku）和堿性亞基B（分子質(zhì)量20 ku）[21]。由圖3可看出，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后，大分子抗原蛋白有著不同程度的降解，尤其是復(fù)合菌劑發(fā)酵后，α亞基和α'亞基條帶完全消失，β亞基、A 亞基顏色變淺，分子量較低的蛋白條帶加深。

2.4 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)致病菌的抑制效果（見(jiàn)圖4～圖6）

圖4 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制效果

圖5 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)沙門氏菌的抑制效果

圖6 功能菌株及其復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)致病菌的抑制效果

大腸桿菌和沙門氏菌是引起腸道疾病的常見(jiàn)致病菌，飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后產(chǎn)生代謝物質(zhì)對(duì)致病菌有一定的抑制作用，可以提高飼料的發(fā)酵效果[23]。不同發(fā)酵時(shí)間復(fù)合菌劑和單菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制活性見(jiàn)圖4～圖6。

由圖4 和圖5 可知，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)浸提物均對(duì)致病菌無(wú)抑制活性。發(fā)酵后，各發(fā)酵產(chǎn)物的浸提液均具有對(duì)致病菌的抑制作用。由圖4可看出，與單菌株發(fā)酵相比，復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制效果顯著（P<0.05），發(fā)酵到第14天時(shí)復(fù)合菌劑發(fā)酵配合飼料抑制大腸桿菌活性為1.18 cm2。由圖5 可知，F(xiàn)M-20 菌株產(chǎn)生抑制沙門氏菌的抗菌物質(zhì)能力較強(qiáng)，在發(fā)酵后期（8-14 d）對(duì)沙門氏菌抑制效果顯著（P<0.05），但發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)與復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物抑制效果無(wú)顯著差別（P>0.05），與JM-1菌株相比，發(fā)酵后期（8-14 d）抑制效果顯著（P<0.05）。由圖6 可以明顯看出，發(fā)酵0 天時(shí)4 種體系的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均無(wú)抑菌圈，發(fā)酵第14 天時(shí)4 種發(fā)酵體系的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)兩種致病菌均有明顯的抑菌圈。從以上試驗(yàn)結(jié)果可得出，飼料經(jīng)微生物發(fā)酵后產(chǎn)生的代謝物質(zhì)對(duì)致病菌有抑制作用，且3 種功能菌株產(chǎn)生協(xié)同作用具有更好的抑菌效果。

3 討論

物料pH的下降和發(fā)酵體系中氧氣的消耗會(huì)為乳酸菌的生長(zhǎng)和厭氧反應(yīng)提供基礎(chǔ)，低pH 有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。田曉玲等[24]指出發(fā)酵過(guò)程乳酸菌會(huì)產(chǎn)生大量消化酶，將飼料里的大分子蛋白降解成氨基酸和多肽，改善動(dòng)物的消化吸收，提高飼料的利用率。舒剛等[25]飼喂青腳麻雞發(fā)酵玉米豆粕日糧，發(fā)現(xiàn)腸道中pH 逐漸降低，雞腸道中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著降低，乳酸菌數(shù)量顯著增加。

本試驗(yàn)中通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物pH的變化可以看出單菌株FM-20的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，相較于另兩種單菌株產(chǎn)酸性效果顯著，JM-1菌株產(chǎn)酸能力較弱，復(fù)合菌劑發(fā)酵體系pH 介于FM-20 和JM-1 之間。由此說(shuō)明3 種菌共同發(fā)酵時(shí)，F(xiàn)M-20菌株主要發(fā)揮了降低pH的作用，但是否因?yàn)閺?fù)合發(fā)酵使FM-20 菌株的生長(zhǎng)繁殖受到了抑制，而使復(fù)合菌劑發(fā)酵pH 降低速度小于FM-20菌株發(fā)酵還需進(jìn)一步驗(yàn)證。復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制作用比單菌株強(qiáng)，并且對(duì)沙門氏菌也有較強(qiáng)的抑制作用。因此，3種益生菌復(fù)合協(xié)同發(fā)酵后微生物產(chǎn)生大量抗菌物質(zhì)抑制致病菌，提高飼料了發(fā)酵質(zhì)量。

配合飼料中豆粕成分提供了所需的蛋白質(zhì)含量，氨基酸組成均衡，其抗原蛋白可以通過(guò)芽孢桿菌的產(chǎn)酶系統(tǒng)降解。芽孢桿菌利用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且分泌多種蛋白酶，這些蛋白酶水解大分子蛋白成有利于動(dòng)物消化吸收的物質(zhì)，并且微生物發(fā)酵飼料不僅能降解飼料中結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子蛋白，還能提高粗蛋白和酸溶蛋白的含量，提高蛋白質(zhì)的利用率[26]。

試驗(yàn)中通過(guò)酸溶蛋白含量和SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白凝膠電泳結(jié)果可以明顯看出，在發(fā)酵后期各菌株的協(xié)同作用提高了復(fù)合菌劑發(fā)酵飼料質(zhì)量。以酸溶蛋白含量來(lái)分析，發(fā)酵前期單菌株發(fā)酵含量高于復(fù)合菌劑，但發(fā)酵后期復(fù)合菌劑發(fā)酵產(chǎn)物酸溶蛋白含量明顯升高，均高于單菌株發(fā)酵產(chǎn)物。另外，從SDS-PAGE凝膠圖可以看出，與單菌株產(chǎn)物相比，復(fù)合菌劑發(fā)酵后大分子蛋白降解效果明顯，小分子量多肽增加明顯，為微生物發(fā)酵飼料后抗原蛋白的降解提供了有力說(shuō)明，這與許多學(xué)者研究結(jié)果一致。楊駿等[27]用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌為菌種發(fā)酵果蔬飼料，以生物量為指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合菌劑發(fā)酵比單菌發(fā)酵粗蛋白含量提高了61.88 g/L，飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提高。湯小朋[28]以木薯渣為原料，黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母為菌種，研究單菌和復(fù)合菌劑發(fā)酵木薯渣的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)合菌劑發(fā)酵效果更好，單菌發(fā)酵后粗蛋白含量提高了4.81%，復(fù)合菌劑發(fā)酵粗蛋白含量提高了7.15%。黃曉霞[29]以柚皮為原料，以啤酒酵母和黑曲霉為菌種進(jìn)行單菌和復(fù)合菌劑發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌劑發(fā)酵比單菌發(fā)酵效果好，粗蛋白含量提高到28.78%，是原料的6～7 倍，且發(fā)酵后飼料適口性好。但也有學(xué)者得出不同結(jié)論，譚顯東等[30]以康寧木霉菌和熱帶假絲酵母為菌種發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料，試驗(yàn)結(jié)果得出發(fā)酵中后期單菌發(fā)酵體系的真蛋白含量更高。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究了復(fù)合菌劑和各功能菌株對(duì)固態(tài)發(fā)酵雞配合飼料質(zhì)量的影響，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物的物料pH、酸溶蛋白含量、對(duì)致病菌的抑制效果和SDS-PAGE 凝膠電泳法檢測(cè)抗原蛋白降解的程度來(lái)評(píng)價(jià)飼料質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同功能菌株具有不同的發(fā)酵效果，經(jīng)過(guò)復(fù)配之后，在多個(gè)指標(biāo)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，尤其是物料pH、大腸桿菌的抑制活性、酸溶蛋白含量和抗原蛋白的降解方面具有協(xié)同效應(yīng)。

微生物發(fā)酵飼料已成為畜牧生產(chǎn)中不可缺少的一部分，它既解決了資源浪費(fèi)問(wèn)題，還具有環(huán)保、綠色、健康等特點(diǎn)，是未來(lái)飼料行業(yè)的重點(diǎn)。本研究對(duì)于豐富發(fā)酵微生物菌種及擴(kuò)大其應(yīng)用、提高飼料品質(zhì)具有重要的作用，為微生物發(fā)酵飼料提供了新思路。