周正海 王利剛 陳欣 吳丹 張婧 付莎莉 費(fèi)云滟

摘要：了解重慶地區(qū)銷售禽畜血制品源性成分情況，為開展市場上禽畜血制品制假、售假、販假風(fēng)險(xiǎn)評估提供數(shù)據(jù)支持。文中采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對29份樣品進(jìn)行鴨、雞和豬源性成分測定。其中8份鴨血中全部檢測出鴨源性成分，4份檢出雞源性成分。21份血旺中，檢出豬源性成分16份，檢出鴨源性成分3份，檢出雞源性成分7份。

關(guān)鍵詞：禽畜血制品;源性成分;實(shí)時(shí)熒光PCR

Investigation and Analysis Report on Origin Components of Livestock Blood Products in Chongqing Market

ZHOU Zheng-Hai， WANG Li-Gang， CHEN Xin， WU Dan， ZHANG Jing， FU Sha-Li， FEI Yun-Yan

（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

Abstract： By knowing the sales of source ingredients of livestock and blood products in Chongqing， this study provides data support for risk assessment of manufacturing， selling and selling counterfeits livestock and blood products in the market. Determining 29 samples of duck， chicken and pig by real-time PCR， duck origin components were detected in 8 samples and chicken origin components were detected in 4 samples. Among the 21 samples， 16 were identified as porcine， 3 as duck and 7 as chicken.

Key Words： Livestock blood products; Ingredients; Real-time PCR

1 引言

重慶以美食之都聞名，火鍋、串串更是當(dāng)?shù)氐奶厣朗?，已?jīng)成為當(dāng)?shù)貥?biāo)簽。而鴨血和血旺是火鍋、串串必點(diǎn)菜品之一，深受大眾喜愛。鴨血、雞血、豬血在營養(yǎng)價(jià)值和口感上，豬血最差，且成本最低。鴨血的紅細(xì)胞素含量較高，雞血中鐵元素以血紅素鐵形式存在，兩者較為容易被人體吸收利用。從能量和鐵鉀磷等營養(yǎng)元素含量來看，鴨血和雞血明顯優(yōu)于豬血[1，2]。鴨血質(zhì)構(gòu)嫩滑有彈性、口感細(xì)膩，相比之下，雞血口感偏圓滑，豬血的口感則較為粗糙、且易斷碎[3]。來源上，豬血相較于鴨血和雞血更容易獲取，因此豬血在成本上相對便宜。目前，市場中銷售的禽畜血制品存在摻假造假的現(xiàn)象，如血旺和鴨血標(biāo)識混亂，鴨血中摻加豬血、雞血等，更有甚者使用血粉及其他化學(xué)試劑勾兌出“鴨血”進(jìn)行銷售，不僅欺騙消費(fèi)者，擾亂市場秩序，還有可能損害消費(fèi)者的身體健康。因此，有效的動物源性成分鑒別對維護(hù)市場公平和消費(fèi)者權(quán)益有重要意義。

目前，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的種屬檢測技術(shù)已是食品中肉類成分鑒定的主流技術(shù)[4]。文中隨機(jī)從市面上購買了29份鴨血和血旺，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行鴨、雞和豬源性成分檢測，以了解現(xiàn)狀并積累數(shù)據(jù)。

2? 材料與方法

2.1樣品來源

隨機(jī)采集超市、餐飲店、農(nóng)貿(mào)市場等場所的8份鴨血和21份血旺，共29份樣品。

2.2儀器和試劑

儀器：LightCycler96實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)（瑞士羅氏公司）、Legend Micro21R 高速冷凍離心機(jī)（Thermo）、Nano Drop ONEc 微量核酸蛋白分析儀（Thermo）。

試劑：動物源性基因組DNA提取試劑盒（Takara）、豬源性試劑盒（Takara）、Premix Ex Taq（Takara）、鴨、雞引物探針由華大基因合成。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1? 樣品處理

采用Takara公司基因組DNA提取試劑盒，按照說明書要求取25mg凝固血樣品，置于2mL離心管中，搗碎。加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K和10μL的RNase A，于56℃水浴溫浴4～5小時(shí)至組織完全裂解。

2.3.2? 樣品的總DNA提取

按照說明書提取樣品基因組 DNA，加入200μL Buffer GB和200μL100%乙醇，溶液加入至spin column中，12000rpm離心2min，棄去濾液，加入500μLBuffer WA 12000rpm離心1min，棄去濾液。加入Buffer WB700μL，12000rpm 離心1min，重復(fù)一次。加入無菌去離子水100μL，12000rpm離心2min，收集濾液，作為樣品模板進(jìn)行PCR檢測。提取時(shí)帶無菌超純水作為空白對照，牛肉作為陰性對照，鴨、雞、豬分別作為陽性對照。

2.3.3? 實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測

鴨、雞源性按照標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10923-2012《肉及肉制品中動物源性成分的測定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》檢驗(yàn)[5]。鴨、雞源性成分檢測的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表1，擴(kuò)增條件為50℃2min→95℃10 min→40×（95℃15s→60℃1min）。

豬源性按照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》檢驗(yàn)[6]。豬實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表2，擴(kuò)增條件為95℃10s→40×（95℃5s→60℃ 30s）。

3? 結(jié)果與分析

檢測29份鴨血和血旺中鴨、雞、豬源性成分，檢測結(jié)果見表3。按照SB/T 10923-2012《肉及肉制品中動物源性成分的測定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》要求，鴨和雞做3個(gè)平行。當(dāng)Ct值<30.0時(shí)，判定為檢出;當(dāng)Ct值>35.0時(shí)判定為未檢出;當(dāng)30.0≤Ct值≤35.0時(shí)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若再次出現(xiàn)Ct值≤35.0，則判定為檢出。按照SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》要求，豬做2個(gè)平行。當(dāng)Ct值≤35.0時(shí)，判定為檢出;當(dāng)Ct值>35.0時(shí)判定為未檢出。

檢測29份樣品中，其中8份明標(biāo)為鴨血樣品，全部檢測出鴨源性成分，檢出率100%;有4份同時(shí)檢測出雞源性成分，檢出率為50%。21份血旺中，檢出雞源性成分7份，檢出豬源性成分16份，檢出鴨源性成分3份，其中純豬血14份，純雞血2份。本次實(shí)驗(yàn)中采用SB/T 10923-2012《肉及肉制品中動物源性成分的測定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行豬源性成分檢測時(shí)，存在熒光信號不穩(wěn)定的情況出現(xiàn)，使用SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》進(jìn)行比較，結(jié)果顯示信號較為穩(wěn)定，故本次豬源性成分的檢測采用SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》的檢測結(jié)果。

4 討論

打擊各種食品摻雜使假、以次充好一直是市場監(jiān)管工作的重點(diǎn)，鑒別食品中成分可為市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。因此，動物源性成分檢測在禽畜血制品的監(jiān)管中顯得尤為關(guān)鍵?；贒NA層面的PCR技術(shù)比其他方法更準(zhǔn)確、快速，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)還可以滿足快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測需求[7]。

本次調(diào)查檢測結(jié)果顯示，鴨血中部分檢出雞源性成分，一方面，由于不良商家主動在鴨血中添加雞血，其原因大概是雞血和鴨血口感質(zhì)地都相似，更不易辨別。另一方面，存在交叉污染導(dǎo)致，農(nóng)貿(mào)市場或屠宰點(diǎn)存在雞和鴨同時(shí)宰殺的情況，由于環(huán)境或者盛裝容器等原因不可避免的造成交叉污染。血旺成分以豬血為主，少數(shù)摻雜雞血或鴨血，也存在交叉污染的可能。

本次實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢驗(yàn)，靈敏度較高，檢出限較低，但無法準(zhǔn)確定量，在應(yīng)用到監(jiān)督執(zhí)法時(shí)，仍有較大局限性[8]。一是不能斷定是否為人為摻假。比如，檢測出雞和鴨的Ct值在30～35之間，極有可能為帶入污染。因此，可以精確定量的數(shù)字PCR技術(shù)對于未來的檢測有重大意義。它對樣品進(jìn)行直觀的定量分析，既保持了PCR技術(shù)靈敏、快速的特點(diǎn)，又克服了以往PCR技術(shù)中存在的假陽性污染和無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)[9]。二是對“人造血旺”無法進(jìn)行判定。比如，在“人造血旺”中混入部分天然血，只進(jìn)行源性成分檢測無法斷定，仍需要提高檢測技術(shù)能力和范圍。

參考文獻(xiàn)

[1]王赟，李愛彬，陳湘來，等.豬血的開發(fā)和利用[J].?食品與機(jī)械，2012，28（001）：272-274.

[2]耿永然，汪建明，魯緋.鴨血豆腐感官品質(zhì)評價(jià)指標(biāo)篩選[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（23）：95-98.

[3]李翔.豬血和鴨血豆腐質(zhì)構(gòu)分析（TPA）幾種測試條件的確定[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2015， 40（11）：36-42.

[4]陳穎，吳亞君，徐寶梁，等.食品及飼料中馬屬動物源性成分的PCR檢測研究[J].中國生物工程雜志，?2004， 24（5）：78-78.

[5]肉及肉制品中動物源性成分的測定 實(shí)時(shí)熒光PCR法：SB/T 10923-2012[S].

[6]食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法：SN/T 2051-2008[S].

[7]呂二盼，周正，周巍，等. 動物源性食品鴨血，豬血DNA提取及多重PCR鑒別研究[J].食品工業(yè)科技，?2012，33（16）：228-231.

[8]岳苑.實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測肉制品中雞，鴨源性成分[J].?生物加工過程，2016，14（006）：41-45，53.

[9]張立國，張琚.實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的介紹[J].生物技術(shù)，2003，13（002）：39-40.