孫莉莉，彭麗娜，李 錚，侯睿寧，牟蘊慧

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069；2.哈爾濱體育學院運動人體科學學院，黑龍江 哈爾濱 150008）

【研究意義】李（Prunus salicinaL.）屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，李屬分類復雜且較難區(qū)分，世界上共有30～40 種［1］，國際上將李亞屬分為杏組（Sect.Armeniaca）、真李組（Sect.Euprunus）和櫻李組（Sect.Prunocerasus）［2］。真李組包括中國李（Prunus salicinaLindl.）、杏李（Prunus simoniiCarr.）、烏蘇里李（Prunus ussuriensisKov.&kost.）、歐洲李（Prunus domesticaL.）、櫻桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）及黑刺李（Prunus spinosaL.）等6 種，其中商品李為二倍體的中國李（又稱日本李）和六倍體的歐洲李［3］。我國李屬植物分布廣、適應性強，在浙江、福建、廣東、云南、四川、陜西、東北等地均有馴化栽培的品種［3］，其資源種類及數(shù)量均居世界第1 位［4］。黑龍江省位于我國最北區(qū)域，李的抗寒種質(zhì)資源豐富，與其他作物相比，李的經(jīng)濟效益比較顯著［5］。由于優(yōu)質(zhì)、大果、耐貯運材料稀少，加之傳統(tǒng)育種方法耗時長、成效低，亟需借助分子生物學手段加快育種進程。高質(zhì)量遺傳圖譜的構建是分子標記輔助育種的基礎?！厩叭搜芯窟M展】隨著分子生物學的快速發(fā)展，DNA分子標記技術已經(jīng)成為一種重要研究方法廣泛應用于分子鑒定［6］、雜交種純度分子檢測［7］、種質(zhì)資源多樣性［8-9］、分子遺傳圖譜構建［10］、遺傳多樣性分析［11-13］及指紋圖譜構建［14-15］等多個領域。DNA 分子標記是遺傳圖譜構建的主要手段，孫文英等［16］利用AFLP分子標記技術構建梨（PyrusL.）的遺傳連鎖圖譜。艾小艷等［17］概述了構建桃（Prunus persicaL.）遺傳圖譜的多種分子標記方法，包括基于第一、第二代分子標記的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）、SSR（Simple Sequence Repeat，簡單重復序列）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）和RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機引物擴增多態(tài)性DNA）技術以及基于第三代分子標記的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）技術。另外，Linge 等［18］也利用SNP技術構建桃的高密度遺傳圖譜。章秋平等［19］利 用SSR 和SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）標記構建了兩張杏（Prunus armeniacaL.）遺傳連鎖圖譜。Dang 等［20］通過SRAP、AFLP 和ISSR（Inter-simple Sequence Repeat，內(nèi)部簡單重復序列）標記構建芒果（Mangifera indicaL.）遺傳連鎖圖譜。由此可見，通過分子標記技術構建遺傳連鎖圖譜是切實可行的方法之一。分子遺傳連鎖圖譜主要用于性狀定位、分子標記輔助育種及功能基因克隆研究等，同時在遺傳學、遺傳分子育種及功能基因組學等方面發(fā)揮重要作用［21-23］。此外，對于遺傳背景復雜的木本植物而言，“雙假測交”理論的提出為多年生果樹遺傳圖譜的研究提供了理論依據(jù)［24］?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外有關李的研究主要集中在種質(zhì)資源調(diào)查［3］、遺傳多樣性［25-26］、果實性狀分析［27］等方面，而關于李遺傳連鎖圖譜構建方面的研究鮮見報道［28］。東北地區(qū)獨特的地理環(huán)境和豐富的李種質(zhì)資源，有利于開展優(yōu)質(zhì)、抗寒新品種的選育工作。如前所述，分子標記輔助育種技術可以加快育種進程，而遺傳連鎖圖譜又是分子輔助育種的基礎?！緮M解決的關鍵問題】本研究以東北地區(qū)品種吉林6 號和龍園秋李作為親本，以其F1后代作為作圖群體，通過ISSR 和SRAP 分子標記構建李的遺傳連鎖圖譜，為后續(xù)李的分子輔助育種提供理論依據(jù)，推進優(yōu)質(zhì)、抗寒李品種的選育。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院，以吉林6 號和龍園秋李為親本材料，其中母本為吉林6 號，樹勢矮小，果實較小，平均單果質(zhì)量40 g，果實成熟時為紅色，離核，8 月中旬果實成熟；父本為龍園秋李（九三杏梅×臺灣李），抗寒、豐產(chǎn)、樹姿直立，耐紅點病；果實扁圓形，平均單果質(zhì)量75 g，最大果質(zhì)量110 g；成熟時全面紫紅色，半離核，較耐貯運，9 月初果實成熟，是北方寒地果實最大品種。

以F1子代實生苗為作圖群體，選取80 個F1子代進行樣本采集。雜交群體于2009 年雜交，2010 年播種，2012 年定植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院園藝分院核果試驗園，長勢較好，稀有開花結果，沒有進行剔選。同時對F1子代進行連續(xù)兩年的數(shù)據(jù)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括部分生長性狀和果實性狀，其中葉片長、寬和果實橫徑、縱徑經(jīng)數(shù)據(jù)分析呈正態(tài)分布（數(shù)據(jù)未顯示），用于QTL 定位分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 分別采集吉林6 號和龍園秋李親本及F1子代植株的幼嫩葉片，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)天根植物DNA 提取試劑盒（DP305）的相關步驟進行DNA 的提取，提取后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA 質(zhì)量的檢測，電泳緩沖液為1×TAE，觀察并拍照，用于后續(xù)引物篩選及遺傳圖譜的構建。

1.2.2 F1子代真實性鑒定 根據(jù)本課題組前期工作積累，選取特異性條帶清晰的SSR 引物UDP96-005（F′GTAACGCTCGCTACCACAAA、R′CCTGCATATCACCACCCAG）來鑒定子代的真實性，比較F1群體與雙親的基因型，去除后代中與雙親基因型不一致的植株。

1.2.3 ISSR 及SRAP 引物篩選 試驗所用的ISSR引物從UBC800-UBC900 中隨機選取44 條，SRAP引物采用已公布的引物序列［29］，由me1-me10 及em1-em20 組合成200 對引物進行篩選，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

對親本材料和2 個雜交后代基因組DNA 進行ISSR 和SRAP 引物篩選，試驗選取PCR 擴增條帶清晰、重復性好且多態(tài)性較豐富的14 條ISSR 引物（表1）和16 對SRAP 引物（表2）用于后續(xù)研究。

表1 ISSR 引物序列Table 1 Sequences of ISSR primers

表2 SRAP 引物序列Table 2 Sequences of SRAP primers

1.2.4 PCR 擴增 ISSR-PCR 反應體系為20 μL：10 × PCR Buffer 2 μL，引物（50 pmol/μL）2 μL，dNTP （each 10 mmol/L）0.4 μL，模板（DNA）1 μL，TaqPlus DNA Polymerase（2 U/μL）0.5 μL，加ddH2O 14.1 μL。PCR 反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，52～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，40 個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE，150 V，100 mA，30 min 電泳觀察。

SRAP-PCR 反應體系為15 μL：TaqPCR Master Mix，7.5 μL，正向引物（50 pmol/μL）1 μL，反向引物（50 pmol/μL）1 μL，模板（DNA）1μL，加ddH2O 4.5 μL。PCR 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5 個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE，150 V，100 mA，30 min 電泳觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Join Map 4.0 軟件中CP 作圖模型（hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg、ab×cd 等5 種分離類型）的要求，將PCR 所得凝膠結果在Excel 中按照模型要求進行數(shù)據(jù)錄入，將作圖群體個體數(shù)和每個個體的基因型橫向錄入，將引物位點名稱和分離類型縱向錄入，其中hk×hk（雙親均為雜合的基因型，h對k 為顯性）、nn×np（母本為純隱性基因型nn、父本為雜合基因型np，p 對n 為顯性）、lm×ll（母本為雜合基因型lm、父本為純隱性基因型ll，m 對l 為顯性），選用LOD 值為0.5～10.0 的連鎖群，采用Kosambi 函數(shù)計算圖譜距離。本試驗引物編號為引物名+條帶分子量，用于構建李遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取

采用植物DNA 提取試劑盒，分別對2 個親本及80 個F1子代進行DNA 提取，提取后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。部分電泳結果見圖1，圖1 顯示基因組DNA 條帶完整無降解。

圖1 F1 后代DNA 電泳結果Fig.1 Electrophoresis result of DNA from F1 progenies

2.2 F1 子代真實性鑒定

根據(jù)雙親基因型和子代群體的基因型，挑選出與雙親基因型不符的子代，通過篩選有72 個個體為真實性子代，用于后期群體驗證。F1子代真實性部分鑒定結果見圖2，根據(jù)親本條帶分布對子代條帶進行對比分析，如圖2 子代2 和子代10箭頭所示，出現(xiàn)親本中沒有的條帶，被鑒定為非真實性子代，排除群體之外。

圖2 部分F1 子代真實性鑒定結果Fig.2 Authenticity identification results of some F1 progenies

2.3 分子標記的多態(tài)性分析

首先將44 條ISSR 引物、200 對SRAP 引物在親本和2 個真實性后代中進行多態(tài)性篩選，根據(jù)PCR 凝膠結果分析得知，44 條ISSR 引物中有14 條引物條帶穩(wěn)定且清晰，引物比例為31.8%，ISSR 和SRAP 獲得的標記數(shù)量如表3 所示，ISSR 引物產(chǎn)生等位基因數(shù)為74 個，每條引物均產(chǎn)5.3 個；200 對SRAP 引物中有16 對具有多態(tài)性，引物比例為8.0%，SRAP 引物產(chǎn)生等位基因數(shù)為46 個，每對引物均產(chǎn)2.9 個。本研究將篩選出的14 條ISSR 引物和16 對SRAP 引物進行親本和72 個F1后代的PCR 擴增，以構建遺傳圖譜。引物在F1群體中產(chǎn)生標記位點120 個，經(jīng)χ2檢驗后，偏分離位點有9 個，頻率為7.5%。

表3 ISSR 和SRAP 標記的數(shù)量和分離類型Table 3 Number and segregation patterns of ISSR and SRAP markers

2.4 標記分離分析

利用ISSR 和SRAP 分子標記對李F1后代進行親本和群體檢測，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性標記在作圖群體中有不同的分離類型，根據(jù)Join Map 4.0 軟件中的CP 作圖模型，將親本及F1后代的基因型劃分為hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg 和ab×cd 等5 種類型，每種分離類型在ISSR 和SRAP 標記中的數(shù)量如表3 所示，nn×np 類型總數(shù)相對較高。hk×hk型分離比例為1 ∶2 ∶1（圖3A），nn×np 型（圖3B）、lm×ll 型（圖3C）分離比例為1 ∶1，ef×eg 型如圖3D 所示，ab×cd 型如圖3E 所示。

圖3 ISSR 及SRAP 引物檢測到親本和F1 后代中的雜合位點分離類型Fig.3 Segregation pattern of heterozygous loci in parents and F1 progenies detected by ISSR and SRAP primers

2.5 分子遺傳連鎖圖譜的構建

將獲得數(shù)據(jù)導入Join Map 4.0 軟件的CP 模型中，將LOD=5.0 設置為標記連鎖群，同時將偏分離的9 個標記去掉，對120 個標記位點進行分析，成功構建了李遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含38 個標記，其中ISSR 標記31 個、SRAP 標記7個，分布在16 個遺傳連鎖群內(nèi)，如圖4 所示。該遺傳圖譜在李基因組中覆蓋528.5 cM，標記間平均圖距13.9 cM，連鎖群LG1 最長（71.1 cM），LG4 最短（9.6 cM）。分布在連鎖群上的標記數(shù)最多為4 個，最少為2 個。多態(tài)性標記間最大遺傳距離為52.8 cM，位于LG5 的ISSR842-2250 與me1em20-700 之間；最小遺傳距離為1.4 cM，位于LG4 的ISSR880-500 與ISSR880-600 之間。

圖4 李遺傳連鎖圖譜Fig.4 Genetic linkage map of Prunus salicina L.

3 討論

遺傳研究和分子育種方法需要基本的基因組資源，如分子標記和連鎖圖譜。為開發(fā)李遺傳研究資源，本研究利用分子標記方法構建李遺傳連鎖圖譜。李為多年生木本植物，遺傳背景復雜，且為異花授粉植物，很難獲得自交群體［30］，而“雙假測交”理論可以很好地解決這一難題，為李的遺傳圖譜構建和分子輔助育種提供了理論依據(jù)。同時，對遺傳圖譜構建來說，用于作圖的親本和群體選擇尤為重要，遺傳圖譜作圖親本的選擇應以遺傳背景差異較大、親緣關系較遠為好。本研究選擇吉林6 號和龍園秋李為作圖親本，依據(jù)前期遺傳多樣性分析結果顯示，兩者親緣關系較遠［31］，符合遺傳圖譜親本選擇的要求。另外，關于作圖群體數(shù)量的闡述，章秋平等［23］研究表明，核果類果樹遺傳圖譜群體大小范圍為48～297株子代不等，本研究通過F1子代真實性鑒定，72株植株為真實性子代，群體數(shù)量適宜進行遺傳圖譜構建的研究。

分子標記方法具有引物通用性好、操作簡單易行、多態(tài)性好且分布均勻等優(yōu)點，被廣泛應用于許多林木的遺傳連鎖圖譜構建中［32-33］。本研究利用ISSR 和SRAP 分子標記，通過多態(tài)性篩選選出14 條ISSR 引物和16 對SRAP 引物來構建李的遺傳連鎖圖譜。通過查閱文獻得知，關于分子標記引物個數(shù)和標記方法的選擇，不同研究存在較大差異。戰(zhàn)晴晴等［34］利用28 條ISSR 和14 對SSR 多態(tài)性引物構建了北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）遺傳連鎖圖譜，包含72 個ISSR 和8 個SSR 位點；王曉敏等［35］利用14 對SRAP 引物組合、9 條ISSR 引物及10 對TRAP 引物構建了金針菇（Flammulina f iliformis）分子遺傳連鎖圖譜，獲得185個標記位點，其中SRAP 標記76個、ISSR 標記33 個、TRAP 標記74 個、不親和性因子位點2 個。本研究中，共產(chǎn)生120 個清晰穩(wěn)定的標記位點，其中ISSR 標記 74 個、SRAP 標記46 個，最終有38 個標記，其中31 個ISSR 標記和7 個SRAP 標記。由此可見，不同標記的組合選擇可以最大程度地覆蓋基因組，有利于增加圖譜密度和提高圖譜質(zhì)量。

有研究表明，李是一種自交不親和的二倍體種（2n=2X=16）［36］，Juan 等［37］對日本李進行SNP 連鎖分析，獲得8 個連鎖群，同時將不同性狀進行QTL 定位，其中果實成熟時間定位在LG4上，果皮顏色定位在LG3 和LG4 上。Basilio 等［38］利用GBS（Gnotyping-by-Sequencing）方法獲得日本李高質(zhì)量SNP 標記1 441 個，分布在8 個連鎖群內(nèi)。本研究獲得的連鎖群數(shù)為16 個，與上述研究結果不一致，可能原因是本研究采用的分子標記方法較少，獲得的標記數(shù)較少，在基因組中分布較分散導致的，可以通過增加后代和分子標記的數(shù)量來縮小差距、提高連鎖圖譜的密度和分辨率。本研究結果豐富了李遺傳連鎖圖譜的分子標記類型和標記位點，能更好地為李的基因定位和分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

4 結論

本研究構建了李遺傳連鎖圖譜，以東北地區(qū)吉林6 號和龍園秋李為作圖親本，利用SSR 分子標記方法篩選出72 個真實性子代。分別利用14條ISSR 引物獲得74 個等位基因，16 對SRAP 引物產(chǎn)生46 個等位基因。對PCR 擴增結果進行條帶分析，獲得親本及F1后代的5 種基因型，分別是hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg 和ab×cd，其中nn×np 類型數(shù)目相對較高。引物在F1群體中產(chǎn)生標記位點120 個，經(jīng)χ2檢驗后，偏分離頻率為7.5%，利用Join Map 4.0 軟件的CP 作圖模型進行Kosambi 函數(shù)計算，構建含有16 個連鎖群的連鎖圖譜，包含38 個分子標記位點，覆蓋基因組長度為528.5 cM。李遺傳連鎖圖譜的成功構建可以推進東北地區(qū)李優(yōu)質(zhì)、抗寒新品種的選育和生產(chǎn)實踐。