吳 岳，劉皎如﹩，顧存林，唐延軍，趙洪乾，高如陽，吳 穹&

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省刑警總隊，青海 西寧 810000；3.空軍特色醫(yī)學(xué)中心研究部航空衛(wèi)生保障與飛行安全研究室，北京 100089)

腦缺血再灌注損傷涉及線粒體損傷、細胞凋亡和炎癥反應(yīng)等[1-3]。腦缺血再灌注時，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，該部炎癥細胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強、相互促進的級聯(lián)反應(yīng)，并通過一定的炎癥信號通路使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷[1，4，5]。因此，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷機制中擔(dān)負著重要角色。

核轉(zhuǎn)錄因子-kB、TNF-α與炎癥反應(yīng)機制密切相關(guān)，并且是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，研究已證實腦缺血再灌注后NF-kB、TNF-α水平升高[6]。缺血再灌注后產(chǎn)生的TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子被激活后，誘導(dǎo)NF-kB轉(zhuǎn)錄急性期蛋白的基因表達，進一步促進炎癥反應(yīng)，而這些被激活的局部和(或)全身炎癥反應(yīng)則又可通過NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)相關(guān)細胞凋亡[7]。

CD38是一種單鏈II型跨膜糖蛋白，在哺乳動物組織和細胞內(nèi)廣泛分布，并定位于細胞的各種膜結(jié)構(gòu)中。CD38是由一個跨膜域、N端胞質(zhì)尾巴和羧基末端胞外域組成，參與調(diào)節(jié)多種生理病理功能，如T-cell激活、胰島素分泌、突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)元凋亡等[8-9]。研究表明，在創(chuàng)傷性腦損傷中，CD38缺乏可減少(弱)缺血再灌注后的組織后趨化因子的產(chǎn)生、免疫細胞的浸潤和腦損傷[10]。Wei[11]等人的研究證實CD38可介導(dǎo)細胞存活，并能通過調(diào)節(jié)ROS水平介導(dǎo)神經(jīng)分化。在膿毒癥性腦損傷中，大鼠腦組織中的CD38/cADPR信號通路被激活，以保護海馬免受凋亡和氧化應(yīng)激損傷[12]。干擾小鼠腦組織中CD38的表達會影響星形膠質(zhì)細胞發(fā)育[13]。然而，CD38/cADRP通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的具體作用尚不明晰。本研究擬探討CD38在缺血/再灌注誘導(dǎo)的局灶性腦缺血再灌注大鼠腦損傷及在炎癥反應(yīng)中的可能作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物和模型制備

SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)溫度23±1.0 ℃，濕度<54%，購買于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所[動物合格證號：SCXK(甘)2015-0001]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)Kawamura的方法[14]建立大鼠局灶性腦缺血模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)，去毛消毒后，在頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈和頸外動脈，結(jié)扎并切斷頸外動脈，在其殘端剪一小口，插入4.0單絲尼龍魚線，輕推其末端使之由頸外動脈通過分叉部進入頸內(nèi)動脈，插入約18 mm，栓塞右大腦中動脈，栓塞30 min后拉出尼龍線至頸外動脈接茬殘端，使血流再灌注?？p合切口，保溫喂養(yǎng)24 h。

1.1.2 藥物干預(yù)

將實驗組分為空白對照組、模型組和Ad-NC-siRNA組、Ad-si CD38組，其中空白對照組和模型組海馬注射生理鹽水，Ad-NC-siRNA組和Ad-si CD38組分別注射Ad-NC-siRNA和Ad-si CD38。給藥方式：腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠置腦立體定位儀上，減去局部毛發(fā)并消毒，根據(jù)腦離體定位圖譜，于前鹵后3.0 mm、中線兩側(cè)旁開2.0 mm處鉆開顱骨，用微量注射器自腦表面垂直緩慢進針約2.9 mm，注射20 μL相應(yīng)藥物。Ad-si CD38由本實驗室前期實驗構(gòu)建。

1.1.3 標(biāo)本采集

向大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，予仰臥位固定，剪開胸腔，用采血針于心臟采血，離心(1200r/min，10min)分離血清，置-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?jīng)左心室插入灌流針并固定，切開右心耳，灌注生理鹽水，直至肝和肺臟組織變白及右心房流出液澄清為止。斷頭取腦，迅速剝?nèi)〈笫竽X組織，部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于后續(xù)HE染色和免疫組化實驗；部分組織經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RT-PCR、Western blot實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經(jīng)功能評分

于術(shù)后24 h 觀察大鼠神經(jīng)功能缺失情況，根據(jù)Longa報道[15]的評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能進行評分。0分：無癥狀；1分：對側(cè)前爪不能完全伸直；2分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)；3分：站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，喪失意識。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附劑檢測

根據(jù)TNF-α(ml002953，Mlbio)、IL-1β(ml037361，Mlbio)、IL-6(ml0064292，Mlbio)、cADPR Elisa(LC11062，LongchengBio)試劑盒說明書檢測大鼠血清和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6、cADPR含量。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色

將經(jīng)4%多聚甲醛固定后的大鼠腦組織進行石蠟包埋切片。經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇(100%，95%，90%，80%)水化后，行蘇木素-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化。

1.2.4 尼氏染色

石蠟切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟水化后，將切片浸入甲苯胺藍染色液中浸染30 min。取出切片，先后用蒸餾水和70%乙醇洗滌切片，隨后用無水乙醇迅速分化。再次用無水乙醇脫水、二甲苯透明化后，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 免疫組化檢測

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、熱檸檬酸鈉抗原修復(fù)、0.3%H2O2封閉后，滴加一抗(GFAP，Abcam，ab7260)孵育(4℃，過夜)，滴加二抗孵育(37℃，30 min)。切片經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 RT-PCR檢測

取約20 mg凍存的大鼠腦組織，用液氮研磨后加Trizol和氯仿、異丙醇等提取組織總RNA。用超微量分光光度計檢測A260/280以確定RNA濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，RR047A)進行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA作為模板，擴增目標(biāo)基因及內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；熱循環(huán)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。引物信息見表1。

Table 1 Prime information

1.2.7 Western blot實驗

取約20 mg凍存的大鼠腦組織，加裂解液提取組織總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后加變性緩沖液煮沸10 min使之變性。做SDS-PAGE凝膠電泳，在200 mA下濕轉(zhuǎn)50 min，用5%脫脂奶粉在室溫下封膜2 h，將檢測指標(biāo)所對應(yīng)的一抗(CD38，Genetex，GTX37752)置4 ℃冰箱孵育過夜，用TBS清洗3 次，每次10 min。將用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1.5 h，用TBS清洗3 次，每次10 min。以ECL光化學(xué)法顯色，通過自動曝光系統(tǒng)曝光、拍照、分析。實驗用到的一抗有CD38(Genetex，GTX37752)、NF-kB p65(Abcam，ab16502)、TNF-α(Abcam，ab212899)、IL-1β(Abcam，ab9722)和IL-6(Abcam，ab9324)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織中CD38的表達

對大鼠腦組織中的CD38 mRNA和蛋白表達水平進行了檢測，結(jié)果見圖1。與空白對照組比較，模型組大鼠腦組織中CD38 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組大鼠腦組織中CD38 mRNA和蛋白表達水平均無顯著變化(P>0.05)，Ad-si CD38組大鼠腦組織中CD38 mRNA和蛋白表達水平均明顯減少(P<0.05)。

A：mRNA expression level；B：Protein expression level.Vs blank group**：P<0.01；vs model group，##：P<0.01Figure 1 Expression of CD38 in brain tissue in rats

2.2 CD38對大鼠神經(jīng)功能缺失的影響

根據(jù)ZeaLonga評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠腦組織神經(jīng)功能進行了評分，結(jié)果見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠腦損傷嚴(yán)重(P<0.05)；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組腦組織神經(jīng)功能無顯著變化(P>0.05)，Ad-si CD38組大鼠腦組織損傷有所改善(P<0.05)。

Table 2 Neurological function scores after cerebral ischemia-reperfusion injury in

2.3 CD38對大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和cADPR含量的影響

對大鼠血清和腦組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6和cADPR含量進行了測定，結(jié)果見圖2。與空白對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和cADPR含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和cADPR含量無顯著變化(P>0.05)，Ad-si CD38組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和cADPR含量明顯減少(P<0.05)。

Vs blank group，**：P<0.01；vs model group，#：P<0.05，##：P<0.01Figure 2 Changes of TNF-α，IL-1β，IL-6 and cADPR levels in serum of rats

2.4 CD38對大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

采用HE染色法觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化，見圖3?？瞻讓φ战M大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，椎體細胞排列整齊、形態(tài)正常、著色均勻，胞漿呈淡紅色，胞核呈藍色且較清亮；與空白對照組比較，模型組海馬組織結(jié)構(gòu)明顯異常，椎體細胞排列紊亂、間隙變寬，神經(jīng)元變性明顯，并伴有細胞皺縮現(xiàn)象；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組大鼠海馬組織形態(tài)無明顯差異，Ad-si CD38組海馬組織損傷程度明顯減輕，組織中神經(jīng)細胞排列較紊亂，可見細胞皺縮現(xiàn)象。

Figure 3 Effects of CD38 on brain histomorphology in rats(HE staining，400×)

2.5 CD38對大鼠腦神經(jīng)元形態(tài)的影響

采用尼氏染色法觀察大鼠神經(jīng)元形態(tài)變化，見圖4。光鏡下可見空白對照組大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，尼氏小體數(shù)量多且著色均勻。與空白對照組比較，模型組海馬區(qū)神經(jīng)元稀疏、排列紊亂，細胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，部分胞質(zhì)自溶，尼氏小體明顯減少，胞核體積變小、固縮深染；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)接近，差異不大；Ad-si CD38組海馬區(qū)神經(jīng)元排列較整齊，細胞體積較小，形態(tài)較規(guī)則，尼氏小體增多，神經(jīng)元損傷較輕。

Vs blank group，**：P<0.01；vs model group，#：P<0.05，##：P<0.01Figure 4 Morphological changes of brain neurons in rats(Nissner′s staining，400×)

2.6 CD38對大鼠腦組織GFA表達的影響

采用免疫組化法檢測大鼠腦海馬組織中GFAP表達水平，見圖5?？瞻讓φ战M可見少量的GFAP、NF-kB p65和TNF-α陽性細胞；與空白對照組比較，模型組GFAP、NF-kB p65和TNF-α陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組的GFAP、NF-kB p65和TNF-α陽性細胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)，Ad-si CD38組的GFAP、NF-kB p65和TNF-α陽性細胞明顯減少(P<0.01)。

Vs blank group，**：P<0.01；vs model group，#：P<0.05，##：P<0.01Figure 5 GFAP expression of brain tissue in rats(immunohistochemistry，400×)

2.7 CD38對大鼠腦組織NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白表達的影響

采用RT-PCR法對NF-kB 、TNF-α、IL-1β和IL-6等因子的mRNA表達水平進行檢測，見圖6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，模型組NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Ad-NC-siRNA組NF-kB、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達無明顯變化(P>0.05)，Ad-si CD38組海馬組織NF-kB 、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達明顯減少(P<0.05)。

Vs blank group，**：P<0.01；vs model group，#：P<0.05，##：P<0.01Figure 6 Effects of CD38 on the NF-KB，TNF-α，IL-1β and IL-6 and protein expression levels of brain tissue detected by RT-PCR in rats

采用Western blot法對NF-kB、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-si CD38干預(yù)可顯著降低大鼠腦組織中NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平，其變化趨勢與RT-PCR結(jié)果一致，見圖7。

Vs blank group，**：P<0.01；vs model group，#：P<0.05，##：P<0.01Figure 7 Effects of CD38 on the NF-KB P65，TNF-α，IL-1β，IL-6 and proteins expression of brain tissue detected by Western blot in rats

3 討論

缺血再灌注腦損傷病理生理過程復(fù)雜，常以缺血、缺氧引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)能量衰竭為觸發(fā)點，造成一系列的缺血損傷級聯(lián)反應(yīng)，其中涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子的變化和相互作用[2，16]。腦缺血再灌注時引起的炎癥反應(yīng)，尤其是再灌注時炎癥反應(yīng)更明顯[17]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織CD38表達上調(diào)。因此，我們構(gòu)建了CD38干擾慢病毒，向大鼠海馬CA1區(qū)注射CD38 shRNA干擾慢病毒，發(fā)現(xiàn)CD38 shRNA慢病毒能夠顯著降低海馬組織CD38 mRNA和蛋白表達水平。此外，我們發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)CD38表達可下調(diào)NF-kB、TNF-α、NF-kB、IL-1β等炎癥因子水平來改善灌注損傷誘導(dǎo)的腦損傷。

作為細胞膜受體蛋白，CD38主要表達于多種免疫細胞表面，與內(nèi)皮細胞表面的CD31相互作用，介導(dǎo)T細胞活化、白細胞分裂增殖、細胞黏附、細胞遷移過程，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[18]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD38主要來源于與損傷相關(guān)的膠質(zhì)細胞，通過調(diào)節(jié)cADP核糖水解酶和ADP核糖環(huán)化酶活性，參與合成cADPR、NAADP，間接激活I(lǐng)P3受體或RYP，從而參與神經(jīng)組織炎性損傷應(yīng)答。研究顯示，腦組織中CD38的高表達可引起鈣離子過度釋放，使星形膠質(zhì)細胞增量釋放谷氨酸，進而導(dǎo)致神經(jīng)元中鈣積聚，產(chǎn)生神經(jīng)毒性[8]。而神經(jīng)遞質(zhì)的過度積聚是神經(jīng)元損傷和死亡的關(guān)鍵因素。Peng等[19]學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲除膿毒癥大鼠海馬組織NAD+、cADPR和CD38水平顯著升高，敲除CD38后可明顯改善膿毒癥大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)損傷和細胞凋亡情況。CD38/cADPR信號在腦缺血損傷中被激活，阻斷這一途徑可明顯改善腦損傷。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在局灶性缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷發(fā)生后，大鼠海馬組織CD38和cADPR水平顯著上調(diào)；當(dāng)CD38水平被下調(diào)后，大鼠腦組織中的CD38、cADPR水平顯著下調(diào)，這與前人的研究結(jié)果一致。

NF-kB是調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，在調(diào)節(jié)腦缺血再灌注炎癥反應(yīng)中起中心環(huán)節(jié)作用。在多項研究中證實，腦缺血再灌注可激活NF-kB[20]。腦缺血再灌注后，激活后的NF-kB與IkB解離，同時IkB磷酸化被降解，NF-kB從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，核NF-kB表達顯著增加，引起其調(diào)控的靶基因TNF-α的表達量也顯著增加，進一步促進炎癥反應(yīng)，加重腦缺血再灌注損傷[21-22]。在灌注早期產(chǎn)生的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等前炎性細胞因子是缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的分子基礎(chǔ)，主要介導(dǎo)免疫和炎性反應(yīng)[23]。Barone[24]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在行大鼠腦缺血再灌注時向前腦室注射TNF-α可明顯增加腦梗死面積，而anti-TNF-α可降低內(nèi)源性TNF-α活性，減輕腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注后，受損部位的內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞和血管周圍的炎性細胞即被激活，通過釋放TNF-α、IL-1β而觸發(fā)炎癥反應(yīng)[25-26]。CD38可通過影響腦缺血后免疫細胞的激活和募集，介導(dǎo)腦損傷中的炎癥過程[27]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CD38表達后，大鼠血清和腦組織NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著下降。

此外，星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分，對神經(jīng)元有重要的支持、營養(yǎng)和保護作用，在行腦缺血再灌注后可被各種致炎因素激活，激活的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞又可以釋放IL-1β、TNF-α、NO等多種炎性細胞因子，加速神經(jīng)元的損傷[28-29]。有研究表明，GFAP作為星形膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)的標(biāo)志，在腦缺血再灌注后其表達水平顯著升高[30]。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注后大鼠腦組織中GFAP蛋白表達水平顯著升高；當(dāng)下調(diào)CD38表達后，GFAP表達水平顯著降低，說明CD38能抑制星形膠質(zhì)細胞的過度活化。

綜上所述，我們認為，CD38在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，下調(diào)CD38表達后可通過抑制星形膠質(zhì)細胞的過度活化，減少腦組織中炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，改善缺血再灌注后腦神經(jīng)元損傷。CD38有望成為治療腦缺血及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點。