黃金莎，代姝函，徐 莉，閆云君

華中科技大學生命科學與技術學院，分子生物物理教育部重點實驗室（華中科技大學），湖北 武漢 430074

脂肪酶（lipase E.C.3.1.1.3）具有良好的化學選擇性、區(qū)域選擇性和對映選擇性，能夠催化多種天然和非天然底物的水解或合成反應［1-2］，廣泛應用于制藥、食品、飲料、化妝品、醫(yī)療診斷、洗滌劑和紙張等行業(yè)［3-4］。脂肪酶反應條件溫和，具有天然耐有機溶劑的特性，在非水相反應中表現(xiàn)出優(yōu)異的催化能力，可用于外消旋化合物的動力學拆分［5］，這些反應中產生的高光學純度化合物是制藥工業(yè)的重要組成部分。

脂肪酶的三維結構研究表明，大多數(shù)脂肪酶具有共同的α/β水解酶折疊特征、Ser-His-Asp/Glu組成的催化三聯(lián)體和保守序列G-X1-S-X2-G。脂肪酶的活性位點位于蛋白質結構中β折疊頂部的口袋內部［6］。Pleiss等根據其結合位點的幾何形狀將脂肪酶分為3類（圖1）：（1）位于蛋白表面附近的具有疏水性的裂縫狀（crevice-like）結合口袋的脂肪酶，例如米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor mieheilipase，RML），華根霉脂肪酶（Rhizopus chinensislipase，RCL），米根霉脂肪酶（R.oryzaelipase，ROL），及疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosuslipase，TLL）等；（2）具有漏斗狀（funnel-like）結合口袋的脂肪酶，如南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B，CALB），洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶（Burkholderia cepacialipase，BCL），洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，PCL），及哺乳動物胰脂肪酶等；（3）具有隧道狀（tunnel-like）結合口袋的脂肪酶，如皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase，CRL）。大多數(shù)的脂肪酶具有“蓋子”結構，通常由1個或多個α螺旋組成，通過柔性結構與酶主體結構相連。它在油水界面產生構象變化，使底物能夠進入活性位點；相反，當界面消失時蓋子閉合，活性位點入口被阻斷，酶失去或顯示較低酶活性。

圖1 脂肪酶底物結合口袋的形狀：（a）裂縫狀，（b）漏斗狀，（c）隧道狀Fig.1 Shape of three types of binding site of lipases：（a）crevice-like，（b）funnel-like，（c）tunnel-like

脂肪酶催化機制復雜，其活性位點與底物間相互作用決定了其對特定底物具有高度特異性［7-8］。因此，篩選、挖掘具有特異的對映選擇性的脂肪酶資源，開發(fā)拆分特定手性分子的新策略極具挑戰(zhàn)性。當前改良現(xiàn)有已知的脂肪酶對目標分子的對映選擇性的策略主要概括為2方面［9-11］：（1）從自然界中尋找具有所需選擇性的特定的脂肪酶資源，但其任務艱巨成功率不高；（2）蛋白質工程改造已有的脂肪酶或者從頭設計新酶。其中定向進化（directed evolution）、半理性設計（semirational design）、理性設計（rational design）是目前改善脂肪酶對映選擇性的最常用策略［12］。本文通過分析脂肪酶中影響特定底物對映選擇性的相關區(qū)域的關鍵氨基酸，梳理如何通過蛋白質工程手段改進其對映選擇性。

1 對映選擇性的量化參數(shù)

在脂肪酶動力學拆分外消旋化合物中，有兩個重要參數(shù)，對映體比率（enantio selectivity，E）和對映體過剩值（enantiomeric excess，ee）。

對映體過剩值ee表示其光學產率，即2個對映體之間的關系。它可以根據底物（eeS）或產物（eeP）定義，通常以百分比表示（公式1，2）：

其中S代表手性底物，P代表手性產物，下標R和S分別代表R-對映體和S-對映體。外消旋體的ee值為零，純的對映體化合物的ee值為100%。

對映體選擇率E表示催化劑的拆分效率，是一個綜合評價值，大小和對映體選擇性的高低成正比，它是由兩種底物對映異構體的特異性常數(shù)之比給出（公式3）：

其中kR和kS是特異性常數(shù)，kcatR和kcatS是催化常數(shù)，KMR和KMS是飽和常數(shù)；下標R和S分別表示底物的R-和S-對映體。本文采用ER和ES表示脂肪酶的對映體偏好性，其中下標R和S分別表示底物的R-和S-對映體。

2 改造脂肪酶對映選擇性的蛋白質工程策略

蛋白質工程策略主要包括定向進化、半理性設計和理性設計［2，12-14］。隨機進化策略和借助生物信息學方法、有針對性地改造蛋白質的半理性設計及理性設計是迄今為止改善脂肪酶對映選擇性的最常用定向進化策略。本文主要總結已報道的改善脂肪酶的對映選擇性的蛋白質工程方法，如表1和表2所示。

2.1 定向進化（directed evolution）

定向進化通過誘變、篩選和選擇的反復循環(huán)來模擬體外的自然進化過程，積累有益的突變［1，15］，且具有不需要脂肪酶的先驗結構和功能背景知識等優(yōu)點［16］。誘變中使用的主要方法包括以易錯PCR（error-prone PCR，epPCR）［17］和飽和突變（saturation mutagenesis，SM）［12］為代表的非重組技術及以DNA shuffling［18］為代表的DNA重組技術。Reetz等［19］使用epPCR生成銅綠假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas aeruginosalipase，PAL）突變體，用于水解外消旋酯（R，S）-對硝基苯基-2-甲基癸酸酯，其中一個突變體的S-對映異構體選擇性（ES=10）是野生型PAL（ES=1.1）的10倍。使用定向進化獲得具有改進對映選擇性的突變體的瓶頸在于突變體文庫的規(guī)模非常大，不利于篩選，可靠且靈敏的高通量篩選方法是成功的必要條件［20］。

2.2 理性設計（rational design）

理性設計是基于對酶的結構和功能的廣泛了解［1，14］，通過分析酶的結構，對多序列進行比對，并使用計算方法進行分子動力學模擬，可以更精準的評估蛋白質序列中最有可能的目標位點，因此理性設計策略生成的突變體文庫比定向進化方法生成的文庫小得多［18，21］。計算過程中識別的蛋白質序列中可能的目標位點，通常被稱為熱點（hotspots）。常用的定點突變的方法是重疊延伸PCR或全質粒單輪PCR［22］。我們團隊基于針對酶活性中心的“Inside-out”設計策略，使用量子化學方法計算出穩(wěn)定過渡態(tài)的理論酶，通過RosettaMatch篩選能夠容納該理論酶構象的支架蛋白庫，然后RosettaDesign設計優(yōu)化匹配后構型，最終成功設計了特異性催化對硝基苯酚乙酸酯的酯酶［23］。Moharana等［24］通過分析ω-3脂肪酸的結構信息，計算酶-底物親和力，縮小了喜熱噬油芽胞桿菌脂肪酶（Geobacillus thermoleovoranslipase，GTL）活性位點的脂肪酸結合通道，限制水解過程中對較大的ω-3脂肪酸的識別和結合，獲得的突變體具有較強的ω-3脂肪酸富集能力。

2.3 半理性設計（semi-rational design）

半理性設計策略是通過與理性工具相結合的定向進化實現(xiàn)的，克服了每一種孤立方法的局限性。半理性設計方法依靠序列和結構信息，結合計算預測算法生成突變體，突變文庫的規(guī)模，減小了篩選工作量，提高酶分子改造效率。半理性設計有一個經典的方法-位點飽和突變。20世紀90年代，Reetz教授開發(fā)了組合活性中心飽和突變策略（combinatorial active-site saturation test，CAST）及迭代飽和突變技術（iterative saturation mutagenesis，ISM）［25-26］。Sun等［27-28］在CAST基礎上開發(fā)了三密碼子飽和突變技術（triple-code saturation mutagenesis，TCSM），進一步降低了篩選工作量。2019年Reetz教授與吳起團隊合作開發(fā)了Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis（FRISM）策略［29］，獲得了4個在外消旋底物的酯交換反應中具有高度立體互補的南極假絲酵母脂肪酶B突變體。通過迭代位點特異性誘變積累單個突變形成超小突變體文庫（＜100），得到的突變體對所有4種可能的立體異構體均實現(xiàn)了大于90%的選擇性［30］。

3 改善脂肪酶對映選擇性的關鍵突變位點

蛋白質工程改造脂肪酶對映選擇性，旨在確定提高對映選擇性突變的關鍵位置，以獲得的最佳對映選擇性結果。由于酶的活性中心對脂肪酶的催化活性起著至關重要的作用，因此包含催化位點和底物結合位點的催化裂縫（catalytic cleft）成為了脂肪酶改造的熱點區(qū)域［14，31］。圖2顯示了洋蔥假單胞菌脂肪酶PCL催化裂縫結構中底物結合 位 點 的 幾 個 區(qū) 域［32］：（1）酰 基 結 合 口 袋（hydrophobic crevice）為脂肪酸?；溄Y合區(qū)域，是對三?；视偷闹舅岵糠志哂懈哂H和力的非極性區(qū)域，而在合成反應中，羧酸部分朝著它定向；（2）疏水腔（hydrophobic dent），大且淺的疏水區(qū)域，能夠結合手性醇的大的疏水取代基；（3）親水腔（hydrophilic trench），靠近催化Ser“入口區(qū)域”，可作為手性醇部分中等大小取代基的結合位點；（4）氧陰離子洞（oxyanion hole），穩(wěn)定過渡狀態(tài)下形成的四面體中間體。Bornscheuer等［33］提出將催化裂縫分成羧酸結合部分和酰基結合部分兩個區(qū)域，其中，羧酸結合部分是較大的疏水口袋；而?；Y合部分是較小的醇結合部分?；谏鲜龇治觯ㄎ淮呋芽p中關鍵區(qū)域的突變位點，取決于手性底物是羧酸還是醇。即當?shù)孜锸峭庀人釙r，最好的突變位于酰基結合口袋、疏水腔和氧陰離子洞。另一方面，當?shù)孜锸峭庀紩r，突變集中在疏水腔、親水腔以及氧陰離子洞。

圖2 洋蔥假單胞菌脂肪酶催化裂縫結構［31］Fig.2 Catalytic cleft of Pseudomonas cepacia lipase

3.1 脂肪酶對外消旋羧酸立體選擇性改造

在涉及手性羧酸部分的拆分反應中，反應的方向（合成或水解）影響突變位點的選擇。在合成反應中，羧酸是首先進入催化裂隙的底物。已使用計算機模擬了手性羧酸的對映異構體與催化裂隙之間的相互作用，確定控制對映選擇性的關鍵氨基酸位置（表1）。

表1 蛋白質工程改善脂肪酶對外消旋羧酸對映選擇性的部分研究Tab.1 Improving enantioselectivity of lipase towards racemic carboxylic acid by protein engineering

這些研究中使用最多的脂肪酶是南極假絲酵母脂肪酶B。Gu等［34］使用分子對接研究了不同底物的酰基部分的變化（乙?；蚨□；Φ孜锱c催化裂縫中氨基酸殘基間相互作用的影響。被鑒定的關鍵殘基是位于酰基結合口袋和疏水腔中的W104，D134，Q157和I189，以及位于CALB的α-螺旋10上的L278，A282和I285。后來，研究人員［35-37］使用計算機模擬方法識別了不同底物的關鍵殘基，不僅有先前驗證的W104，D134，Q157和I189，還有L144，V149，V190和V154［34］。CALB的這些研究結果表明，即使關鍵殘基大多數(shù)集中于酰基結合口袋中，催化裂縫裂隙的其他區(qū)域（如疏水腔）中的突變也有助于改善CALB的對映選擇性。

南極假絲酵母脂肪酶A在合成反應中的使用少于CALB。但是，它具有的一些非同尋常的特性（如熱穩(wěn)定的，能在90℃以上的溫度下起作用），已經激發(fā)了越來越多研究者的興趣，以期提高其對映選擇性。對三酰基甘油酯的水解具有特定的sn-2特質，并且可以催化側鏈基團較大的底物，例如叔醇［38］。Engstr?m等［39］組合突變酰基結合口袋中的F149Y，I150N和F233G，得到的突變體對7種不同酯的E值為45-276，與野生型的2-20相比，有很大的提高。且對于大多數(shù)底物而言，活性也增加了30倍。更有趣的是，F(xiàn)rushicheva等［40］將量子力學/分子力學（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）方法用于硝基苯基2-甲基庚酸酯的水解反應。與野生型相比，得到的組合突變體（F149Y/I150N/F233G）實現(xiàn)了R-向S-對映異構體的逆轉。

洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶BCL常作為模型用于改造對映選擇性的突變研究。野生型脂肪酶對于（R，S）-1，4-二氫吡啶的水解是R-對映選擇性的，突變體V266L，L287I和F221L（疏水腔中）卻表現(xiàn)出相反的對映選擇性（S-對映選擇性）［41］。Koga等［5］確定了4個關鍵氨基酸：氧陰離子洞中的L17、?；Y合口袋中的F119和L167、疏水腔中的L266；獲得的2個突變體（突變體1：L17F/F119L/L167G/L266V/T251A，突 變 體2：L17F/F119L/L167A/L266V/D21N））具有反向對映體選擇和相對高的對映選擇性。其中L167被較小的甘氨酸Gly和丙氨酸Ala取代擴大了催化裂縫的體積，促進了與對映體的結合。

Reetz等［19］使用定向進化改進PAL在（R，S）-對硝基苯基-2-甲基癸酸酯水解中的對映選擇性，獲得了具有S-對映選擇性的PAL突變體（ES=11）。Prasad等［42］在PAL的幾個特定氨基酸（氧陰離子洞中的M16和L17，酰基結合口袋中的L159、L162、L231和V232）進行了迭代飽和誘變，試圖提高其對（R，S）-2-甲基癸酸酯的對映選擇性，獲得的最佳組合突變體（M16A/L17F/L159V/L162V）ES值（S-對映選擇性）提高到436。

2011年，Ni等［43］系統(tǒng)地研究了枯草芽孢桿菌脂肪酶（Bacillus subtilislipase A，LipA），使用QM/MM及分子對接策略，解析了其對（R，S）-酮洛芬乙烯基酯的立體選擇性。實驗結果與理論預測相吻合：M 78（氧陰離子洞中）和V136（疏水腔中）可通過穩(wěn)定R-酮洛芬乙烯基酯末端苯基影響對映選擇性。

皺褶假絲酵母脂肪酶CRL能特異性水解S-酮洛芬甲酯，Manetti等［44］使用分子對接技術分析了影響（R，S）-酮洛芬甲酯水解的關鍵氨基酸，試圖通過組合突變F344V/F345V（疏水腔）提高R-對映異構體的反應速率。但突變影響了苯丙氨酸Phe側鏈與酮洛芬的芳香族的相互作用，降低了酶與底物結合的自由能，ES從27降低到5。

綜上所述，影響羧酸手性識別的主要位點在疏水腔、氧陰離子洞和?；Y合口袋中。一般而言，用較小的氨基酸替換較大的氨基酸殘基可能會增加脂肪酶的對應選擇性，或逆轉脂肪酶的對映選擇性。

3.2 脂肪酶對外消旋醇的立體選擇性改造研究

正如上述外消旋羧酸研究中所觀察到的，某些關鍵位置會影響脂肪酶對手性醇的對映選擇性，這些位點多數(shù)位于疏水腔和親水腔中。表2總結了近年來蛋白質工程改善脂肪酶對外消旋醇對映選擇性的部分研究。

表2 蛋白質工程改善脂肪酶對外消旋醇對映選擇性的部分研究Tab.2 Improving enantioselectivity of lipase to racemic alcohols by protein engineering

Liu等［46］使用FlexX對接（網址為https：//www.biosolveit.de/products/#FlexX）和動力學模擬技術研究了CALB與外消旋仲醇的丙烯酸的相互作用，以L278、W104和S47為靶位，構建了104位和278位雙位點飽和突變文庫。然后篩選用于水解丙烯酸羥丙基氨基甲酸酯的文庫。最佳突變體L278A、L278V、L278A/W104F和L278A/W104F/S47A的水解轉化率和酯交換率均高于30%。該研究結果證實了通過改變催化裂縫的體積調節(jié)S-對映異構體與S47，W104和α-螺旋10中L278的相互作用，改變其對應選擇性，實現(xiàn)外消旋醇和酯的高效高活性轉化。

Ema等［47］通過取代位于疏水腔中的I287，改變了BCL對（R，S）-1-苯乙醇的對映選擇性。與野生型BCL的ER值相比，用苯丙氨酸Phe（I287F）替代減少了催化裂隙的體積，使ER值翻倍；而用丙氨酸Ala（I287A）替代增加了催化cleft的體積，ER值降低了18倍。2010年，Ema等［48］在突變體I287F的疏水腔處插入了第二個突變體I290A，得到的組合突變體I287F/I290A對應對映選擇性顯著提高，ER＞200（野生型的ER=5）。表明減小催化裂縫的體積能夠提高對仲醇的對映選擇性。2012年，Ema等［49］又檢測了其他12種羥基兩側具有較大取代基的仲醇底物的動力學拆分，對于所有底物，野生型BCL的E值范圍為1-143，突變體I287F/I290A的ER值均超過200。

Aileen等［50］以（R，S）-1-（2-萘基）乙酸乙酯的水解作為模型反應，使用QM/MM方法識別枯草芽孢桿菌LipA中突變的目標位點。親水腔中靠近催化S77的殘基H76被確定為影響LipA對映選擇性的關鍵氨基酸殘基。與野生型LipA的ER=156相比，突變H76A具有相反的對映選擇性（ES=9），這可能與76位氨基酸殘基的電荷、極性和取向對反應活化能的影響有關。

4 結論與展望

通過分析脂肪酶催化裂縫的特性對動力學拆分中對映選擇性的影響，提出了通過蛋白質工程方法在關鍵區(qū)域引入突變以提高脂肪酶的對映選擇性。在外消旋羧酸的拆分中，影響羧酸手性識別的主要位點在疏水腔、氧陰離子洞和?；Y合口袋中；在外消旋醇的拆分中，影響脂肪酶對映選擇性的關鍵突變位點主要位于親水腔、疏水腔和氧陰離子洞。但目前酶結構和功能解析不夠全面，通過對酶催化裂縫結構進行改造，定向設計具有特定活性的生物催化劑極具挑戰(zhàn)。

隨著計算機技術的發(fā)展、運算能力的提升，酶的三維結構的解析、催化機理的挖掘，結構和功能之間的關系越來越清晰，計算機輔助設計及人工智能在蛋白質設計與改造方面受到前所未有的關注，使得基于特定目的“量身定做”的酶分子成為可能。CASCO［54］是利用RosettaDesign和HTMIMD重新設計酶的催化選擇性的新策略，RosettaDesign生成預定義的底物-結合位點或與過渡態(tài)模型形狀互補的位點的蛋白質序列，使用高通量動力學模擬HTMI-MD預測相對活性和對映選擇性取代大多數(shù)的實驗篩選，提高蛋白質工程工作的可靠性和效率。FuncLib［55］是專門為結合位點添加多點突變而設計的，在進行進化分析和能量計算后，利用預測的穩(wěn)定自由能（DDG）對單點突變進行組合和排序。FuncLib確保不會引入有害的突變，并且它可以解釋合并多個突變所產生的潛在上位性影響。多底物酶特異性工程是促進生物催化在工業(yè)上應用的迫切需要，多化學態(tài)分析（multichemical state analysis，MCSA）策略［56］利用大的結構集合和序列空間針對多個目標底物特異性重新設計酶，為廣泛特異性生物催化劑和特異性多底物酶的設計打開了大門。因此，基于FuncLib、RosettaDesign、CASCO、MCSA等方法重塑底物結合口袋，有望在脂肪酶立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學選擇性以及催化活力的定向進化中設計更高質量的突變體庫，使新型催化劑精準設計變?yōu)楝F(xiàn)實。