張曦戈 費(fèi)棟棟 王埡錚 張楊 王曉雨 葛曉彤 王勤濤

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）是從牙周組織分離的成體干細(xì)胞，具有增殖，自我更新以及多向分化等特性，在牙周組織再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。成骨分化潛能是PDLSCs重要特性，然而，大量研究表明，老年個(gè)體來源的牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs from the old，O-PDLSCs）成骨分化潛能顯著降低，并已成為老年人牙槽骨骨質(zhì)疏松的重要因素［3－7］。因此，對(duì)于增齡相關(guān) PDLSCs成骨分化能力減弱的機(jī)制研究具有重要意義。

未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）是一種細(xì)胞維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性反應(yīng)。UPR主要由三個(gè)跨膜蛋白啟動(dòng)：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK），肌醇需要酶 1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和轉(zhuǎn)錄活化因子6（activating transcription factor-6，ATF6），UPR通過減少蛋白合成，上調(diào)分子伴侶的表達(dá)和促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解以恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［8］。PERK-轉(zhuǎn)錄活化因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）通路是UPR的經(jīng)典通路之一，主要通過抑制蛋白質(zhì)翻譯以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷［9］。有研究表明，衰老因素可影響PERK-ATF4通路，導(dǎo)致細(xì)胞功能改變［10－11］。此外，也有研究證實(shí) PERK-ATF4通路對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化具有重要調(diào)控作用［12－14］。但PERK-ATF4通路是否參與增齡相關(guān)PDLSCs成骨分化能力降低目前尚不可知。本實(shí)驗(yàn)擬探究PERKATF4通路對(duì)增齡性PDLSCs成骨分化能力的調(diào)控作用，以期為老年患者的牙周組織修復(fù)提供新思路。

1 材料與方法

本項(xiàng)研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批號(hào)：IRB-YJ-2018066），所有受試者均簽署了知情同意書。

1.1 主要材料與儀器

α-最低必須培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；青霉素鏈霉素、胰蛋白酶、茜素紅染色液（北京索萊寶公司）；Ⅰ型膠原酶（Bio-Froxx，德國）；PERK基因過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因）；PERK siRNA（Santa Cruz Biotechnology，美國）；總RNA提取試劑 Trizol Reagent（Invitrogen，美國）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa，日本）；YJ-875型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 PDLSCs的分離培養(yǎng)

Y-PDLSCs來源于15～30歲患者健康的第三磨牙及因正畸需要拔除的健康前磨牙，O-PDLSCs來源于55～75歲牙周無明顯炎癥的牙齒，所有患者均無系統(tǒng)性疾病，刮取離體牙牙根中1／3牙周膜，使用Ⅰ型膠原酶于37℃消化40～60 min，每間隔10 min震蕩1次，組織碎片加入完全α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種于六孔板中，在含5%CO2的37℃恒溫孵箱中孵育。實(shí)驗(yàn)過程中使用第3～4代PDLSCs。

1.3 siRNA敲減PERK表達(dá)

將O-PDLSCs接種至六孔板，待細(xì)胞匯合90%～95%時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h對(duì)細(xì)胞換液，加入1.5 mL無雙抗無血清α-MEM培養(yǎng)基；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物和siRNA混合物混勻，室溫靜置20 min，500μL轉(zhuǎn)染混合物加入六孔板中搖勻，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4～6 h更換α-MEM完全培養(yǎng)基。

1.4 PERK過表達(dá)

將Y-PDLSCs接種至六孔板，待細(xì)胞匯合90%～95%時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h對(duì)細(xì)胞換液，加入1.5 mL無雙抗無血清α-MEM培養(yǎng)基；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物和質(zhì)粒復(fù)合物混勻，室溫靜置20 min，500μL轉(zhuǎn)染混合物加入6孔板中搖勻，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4～6 h更換α-MEM完全培養(yǎng)基。

1.5 PDLSCs的成骨誘導(dǎo)

PDLSCs接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合至80%時(shí)加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10 mmol／Lβ-甘油磷酸鈉、0.1μmol／L地塞米松、50mg／L維生素C、10%胎牛血清）。

1.6 茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)28 d后，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗2遍，加入茜素紅染液染色20 min，PBS沖洗2遍，置于鏡下觀察，每孔加入1 mL十六烷基吡啶，室溫放置15min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測540 nm波長的吸光度值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

Trizol提取PDLSCs總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度，配比 20μL反轉(zhuǎn)錄體系（1000 ngRNA，4μL反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液、ddH2O配平），反轉(zhuǎn)錄cDNA；配比10μL反應(yīng)體系（1μL的 cDNA、0.4μL目的基因上下游引物、5μL的 SYBR、3.2μL的ddH2O），以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Y-PDLSCs和O-PDLSCs的成骨分化能力比較

成骨誘導(dǎo)7 d后，采用qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALPL、RUNX2、OCN的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與Y-PDLSCs相比，O-PDLSCs的成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）（圖 1A）。成骨誘導(dǎo)28 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，O-PDLSCs的礦化能力顯著降低（圖1B）。以上結(jié)果均表明，與YPDLSCs相比，O-PDLSCs的成骨分化能力降低。

圖1 Y-PDLSCs和O-PDLSCs的成骨分化能力比較Fig 1 Comparison of the osteogenic differentiation ability between Y-PDLSCs and O-PDLSCs

2.2 Y-PDLSCs和O-PDLSCs中PERK-ATF4通路相關(guān)基因的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Y-PDLSCs相比，OPDLSCs的PERK通路相關(guān)基因GRP78、CHOP、PERK以及ATF4 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 PDLSCs中PERK通路相關(guān)基因的表達(dá)Fig 2 The expression of PERK pathway related genes of PDLSCs

2.3 抑制PERK-ATF4通路對(duì)O-PDLSCs成骨分化能力的影響

PERK siRNA轉(zhuǎn)染O-PDLSCs后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，PERK siRNA轉(zhuǎn)染后，O-PDLSCs的PERK及PERK通路下游分子ATF4的mRNA表達(dá)水平均下降（P＜0.05）（圖 3A）。PERK siRNA可有效抑制O-PDLSCs的PERK-ATF4通路。

PERK siRNA轉(zhuǎn)染O-PDLSCs后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)7 d后，qRT-PCR結(jié)果顯示，抑制O-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，成骨相關(guān)基因ALPL、RUNX2、OCN表達(dá)水平均升高（P＜0.05）（圖 3B）。成骨誘導(dǎo)28 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，抑制 O-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量明顯增加（P＜0.05）（圖 3C）。以上結(jié)果均表明，抑制 PERK-ATF4通路后，O-PDLSCs的成骨分化能力升高。

圖3 敲低PERK對(duì)O-PDLSCs成骨能力的影響Fig 3 The effects of knockdown of PERK on the osteogenic ability of O-PDLSCs

2.4 激活PERK-ATF4通路對(duì)Y-PDLSCs成骨分化能力的影響

用PERK過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Y-PDLSCs后，qRTPCR結(jié)果顯示，Y-PDLSCs的PERK及ATF4的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）（圖 4A）。PERK過表達(dá)質(zhì)?？娠@著激活Y-PDLSCs的PERK-ATF4通路。

PERK過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Y-PDLSCs后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)7 d后，qRT-PCR結(jié)果顯示，激活YPDLSCs的PERK-ATF4通路后，成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.001）（圖 4B）。成骨誘導(dǎo)28 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，激活Y-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量減少（P＜0.05）（圖 4C）。以上結(jié)果均表明，激活 PERK-ATF4通路可降低Y-PDLSCs的成骨分化能力。

圖4 過表達(dá)PERK對(duì)Y-PDLSCs成骨能力的影響Fig 4 The effects of overexpression of PERK on the osteogenic ability of Y-PDLSCs

3 討 論

PDLSCs因其具有自我更新及多向分化潛能等特性，為牙周再生治療提供了可靠來源。而增齡性因素對(duì)PDLSCs成骨分化的負(fù)向調(diào)控限制了其臨床應(yīng)用，并且是老年人牙槽骨骨質(zhì)疏松的重要因素。有研究報(bào)道，不同年齡受試者PDLSCs的成骨能力隨著年齡的增長顯著降低［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于Y-PDLSCs，OPDLSCs的成骨相關(guān)分子ALPL、RUNX2、OCN在基因水平表達(dá)均降低，茜素紅染色結(jié)果也證實(shí)O-PDLSCs的成骨能力顯著降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （endoplasmic reticulum stress，ERS）是指各種原因擾動(dòng)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，使未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累。UPR可減少細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是衰老的標(biāo)志之一，參與了不同組織的衰老［15－17］。PERK-ATF4信號(hào)通路是 UPR的經(jīng)典通路之一。在老年大鼠視網(wǎng)膜中，PERK-ATF4信號(hào)通路被激活，ATF4、CHOP表達(dá)水平升高［18］。此外，PERKATF4通路也參與調(diào)控PDLSCs的成骨分化。較高濃度的TNF-α通過激活PERK-ATF4通路減弱PDLSCs的成骨能力［14，19］。在老年小鼠原代骨細(xì)胞中，UPR相關(guān)分子 ATF4、CHOP表達(dá)升高，導(dǎo)致骨形成減少［20］。但PERK-ATF4通路是否參與增齡相關(guān)PDLSCs成骨能力降低目前尚不明確。本研究證實(shí)O-PDLSCs中PERK-ATF4通路被激活。并在激活或抑制 YPDLSCs，O-PDLSCs中 PERK-ATF4通路后，檢測PDLSCs成骨能力的變化，證實(shí)了增齡性PDLSCs通過激活PERK-ATF4通路調(diào)控成骨分化能力。相反，也有研究報(bào)道，激活 PERK-ATF4通路有助于年輕PDLSCs的成骨分化［12］。另外，循環(huán)機(jī)械力作用可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并通過激活PERK-ATF4通路增強(qiáng)PDLSCs的成骨能力［13］。這種差異可能是由于UPR激活程度不同或細(xì)胞來源不同以及細(xì)胞所處微環(huán)境不同導(dǎo)致的，其具體的調(diào)控機(jī)制需要更全面深入的探索。

綜上，本研究證明了 PERK-ATF4通路在 OPDLSCs中激活并介導(dǎo)了增齡相關(guān)PDLSCs成骨能力的降低。本研究不僅為增齡相關(guān)PDLSCs成骨分化能力的降低提供了一種新的機(jī)制，也為老年患者的牙周再生提供了新思路。