原發(fā)性肝癌（HCC）簡稱肝癌，據(jù)統(tǒng)計，每年全球約有100多萬人被診斷為肝癌。原發(fā)性肝癌在我國的發(fā)病率居惡性腫瘤譜的第4位，死亡率居第2位，因惡性程度高，進展迅速，患者的5年生存率僅12.1%。HCC的治療包括手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)和射頻消融術(shù)，輔以全身性化療、靶向藥物治療等，但針對無法切除的中晚期HCC患者可供選擇的治療方式非常有限，亟待新的治療策略，中西醫(yī)結(jié)合治療方案已是當今HCC研究的熱點問題。

三七為五加科人參屬植物三七Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，是珍貴的道地藥材。其主要成分PNS被廣泛的應(yīng)用于心腦血管疾病和血液系統(tǒng)疾病。PNS能增強機體免疫力、減輕化療藥的毒副作用和抗腫瘤作用，抗腫瘤作用主要集中在體外對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，體內(nèi)抗腫瘤研究相對較少，其可通過增強機體免疫力發(fā)揮抗腫瘤作用，而增強免疫力指標的檢測主要針對免疫器官和免疫細胞因子，對其他免疫指標的報道較少。課題組長期從事三七活性成分抗肝癌的研究，目前未見PNS及PNS與CTX聯(lián)用對肝癌H荷瘤小鼠機體免疫力、抑瘤率和生存期的研究，本研究擬從以上3個方面探討PNS及PNS聯(lián)合CTX對肝癌H荷瘤小鼠的治療作用，將其作為肝癌輔助用藥提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑

PNS（云南西草生物科技開發(fā)公司，批號：20200802）、CTX（安道生）、15%綿羊紅細胞SRBC（Solarbio）、紅細胞裂解液（Solarbio）、胎牛血清（Gibco）、RPMI 1640（Gibco）、ConA（Solarbio）、印度墨汁（Solarbio）、生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司）、豚鼠血清（Solarbio）、TNF-α試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、IL-2試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、凋亡試劑盒（杭州聯(lián)生物技術(shù)股份有限公司）

1.2 儀器與設(shè)備

Partec 流式細胞儀（Partec）、Bio-rad MODEL680型酶標儀（Bio-rad）、TGL 18C低溫高速離心機（湖南湘立有限公司）、XT-2000i型全自動血細胞分析儀（Sysmex）、EDTA-K抗凝管（湖南省瀏陽市醫(yī)用儀具廠）。

1.3 實驗動物

SPF級昆明小鼠，雌性，標準體質(zhì)量（18～22 g），昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2015-0002。本研究涉及到的動物實驗均已通過昆明醫(yī)科大學(xué)實驗倫理審查委員會的倫理審查。

1.4 細胞株

小鼠肝癌H細胞（購于國家實驗細胞資源共享平臺，保存于昆明醫(yī)科大學(xué)云南省暨天然藥物藥理重點實驗室）。

1.5 CCK8法測定PNS對肝癌H22細胞增殖抑制的影響

末次給藥后，禁食不禁水，經(jīng)尾靜脈注射用生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁，劑量0.1 mL/10 g，墨汁注入后立即計時，于注入墨汁后第2、10 min，分別從小鼠內(nèi)眼眥靜脈叢取血20 μL，加入到2 mL 0.1%NaCO溶液中搖勻。以NaCO溶液作空白對照，測光密度值，各設(shè)3個平行孔。將小鼠處死，取肝、脾臟稱重。按下式計算吞噬指數(shù)α。

腫瘤邊緣相對清晰的有8例，邊界全部或部分不清的有9例患者腫瘤周圍脂肪間隙消失。腫瘤累及腸系靜脈、動脈、胰腺的有4例。胃腸道間質(zhì)瘤附近呈線性增厚的有1例，CT增強掃描表現(xiàn)為明顯強化。

山東男籃早期的外援，以實用廉價的東歐球員為主。2000年跟隨外教利馬斯來的后衛(wèi)達柳斯，以及后來入隊的立陶宛同胞、中鋒洛蘭達斯，給人留下了很深刻的印象。兩人雖然并不算是大牌球員，但作風(fēng)強硬技術(shù)扎實。雖然位置不同，但都能組織也能得分，深得球迷的喜歡。也正是他們，給山東隊帶來了歐洲整體籃球的理念，減少了對球星的依賴。

第八，多種措施開源，特別是要利用好非常規(guī)水資源。比如說雨洪資源的利用，現(xiàn)在我們在這方面做了一些工作，在保障安全的前提下，盡可能把汛期的洪水蓄積利用起來。城市現(xiàn)在也搞了雨污分流，充分利用雨水資源。還有中水回用的潛力也非常大。現(xiàn)在每年城市供水總量是507.9億m3，污水處理量331億m3，但是中水回用量只有33億m3，僅相當于1/10。所以說，下一步中水回用是彌補水資源不足的有效途徑。北京市在這方面做了很多工作，2011年用水量36億m3，其中中水回用7億m3。下一步我們還要加大力度，通過開源節(jié)流并重、管理并舉，提高水資源利用效率和效益，有效應(yīng)對農(nóng)業(yè)水資源短缺的問題。

1.6 Annexin V/PI雙熒光染色法觀察PNS對肝癌H22細胞凋亡率的影響

設(shè)置PNS 低（200 μg/mL）、中（400 μg/mL）、高（800 μg/mL）3 個劑量組及生理鹽水陰性對照組，取對數(shù)生長期的肝癌H細胞1×10/mL接種于6孔板，藥物作用24、48 h后，用預(yù)冷PBS離心洗滌，收集1×10～10×10細胞。嚴格按照試劑盒說明書操作，最后于流式細胞儀上檢測正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡及壞死細胞的百分比。

1.7 建立肝癌H22荷瘤小鼠模型

取傳至第3代的肝癌H細胞腹腔培養(yǎng)小鼠，用棉球蘸取75%乙醇擦拭小鼠腹部，無菌條件下，將注射器中的生理鹽水注射液推至小鼠腹腔，抽取腹水，重復(fù)幾次操作，得肝癌H細胞混懸液適量。取20 μL細胞懸液于干凈的EP管中，加入1980 μL生理鹽水，混勻，記數(shù)，細胞活率＞95%用于實驗，以1.0×10/mL、0.2 mL/只，右前肢腋下接種于SPF級昆明種雌性小鼠，正常組不接種。

1.8 分組與給藥

將SPF級昆明種雌性小鼠隨機分為9組，依次為（1）正常組、（2）模型組、（3）PNS低劑量組（120 mg/kg）、（4）PNS中劑量組（240 mg/kg）、（5）PNS高劑量組（480 mg/kg）、（6）CTX 組（25 mg/kg）、（7）PNS 低劑量（120 mg/kg）+CTX組（25 mg/kg）、（8）PNS中劑量（240 mg/kg）+CTX組（25 mg/kg）、（9）PNS 高劑量（480 mg/kg）+CTX 組（25 mg/kg）。第（2）組至第（9）組小鼠右腋皮下接種肝癌H細胞懸液0.2 mL/只，接種后，同1 d，（1）、（2）、（6）組小鼠灌胃給予生理鹽水，其他組灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物，0.1 mL/10 g，連續(xù)給藥10 d，同1 d第（6）組至第（9）組小鼠腹腔注射CTX藥物溶液，0.1 mL/10 g，連續(xù)注射10 d。

1.9 肝癌H22荷瘤小鼠碳廓清實驗

收集第3代處于對數(shù)生長期的肝癌H細胞于15 mL的離心管中，離心、洗滌、稀釋、記數(shù)，將細胞濃度調(diào)至6×10/mL，接種于96孔板，100μL/孔，共種3塊板，將96孔板放至CO孵箱中孵育4 h后，取出后分別加入不同濃度的PNS 溶液，使其終濃度依次為0、100、200、300、400、500、600 μg/mL的PNS，設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔，繼續(xù)孵育24、48、72 h后，取出96孔板加入CCK8溶液10μL/孔，繼續(xù)孵育4 h后，檢測吸光度值，并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（給藥組平均-空白組平均）/（對照組平均-空白組平均）。

模型組的刺激指數(shù)顯著低于正常組（＜0.01）；與模型組相比PNS低、中、高各組刺激指數(shù)均顯著增強（＜0.01）；與CTX組相比，PNS低、中、高+CTX組的刺激指數(shù)均提高，且PNS中、高+CTX組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，表4）。

（為第1次血液采集的吸光度，為第2次血液采集的吸光度；T為第1次血液收集的時間，T為第2次血液收集的時間）。

廣播影視主要是根據(jù)觀眾的需求以主動的方式給他們提供，自行選擇收看節(jié)目的公共服務(wù)。在數(shù)字條件下，我們不但要提供公共服務(wù)，還要提供多樣化、個性化的服務(wù)。因此，節(jié)目內(nèi)容生產(chǎn)將面臨前所未有的巨大需求和挑戰(zhàn)，這就要求傳播內(nèi)容要適應(yīng)社會發(fā)展，從封閉、分散、獨立的傳統(tǒng)服務(wù)模式向開放服務(wù)、個性化服務(wù)、信息聚合服務(wù)轉(zhuǎn)變，按照社會化規(guī)律和市場的要求，進行結(jié)構(gòu)調(diào)整、資源重組、合理分工、高效運行。

1.10 肝癌H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖能力的測定

末次給藥后，禁食不禁水12 h，頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤組織，稱質(zhì)量。抑瘤率IR（%）=（1-治療組平均瘤質(zhì)量/生理鹽水組平均瘤質(zhì)量）×100%。

小鼠脾淋巴細胞增殖活性檢測（MTT法）：小鼠脾細胞懸液（3×10/mL）按100 μL/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，各樣本設(shè)刺激孔及對照孔，各設(shè)3復(fù)孔，刺激孔加入含20 μg/mL 的ConA 培養(yǎng)液100 μL，對照孔加入RPMI 1640培養(yǎng)基100μL，置于37 ℃，5%CO培養(yǎng)箱44 h，取出，于無菌超凈工作臺避光加入20μL/孔的MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止反應(yīng)，加入100 μL/孔的三聯(lián)液溶解紫色結(jié)晶。8～12 h后用酶標儀測吸光度值，計算刺激指數(shù)（SI）∶SI=刺激孔/對照孔。

1.11 ELISA法測定肝癌H22荷瘤小鼠TNF-α、IL-2的水平

末次給藥后，禁食不禁水12 h，小鼠摘眼球采血，樣本由1.5 mL干燥的EP管收集，4 ℃，4000 r/min離心10 min，取上清，待測。采用ELISA法測定小鼠血清中TNF-α、IL-2嚴格按試劑盒說明書的要求操作。

1.12 肝癌H22荷瘤小鼠血清溶血素的測定

案例5 假定有一組變量，其中X1，X2，X3，X4是自變量，Y是因變量，自變量對因變量有影響，測得的數(shù)據(jù)如表14.試求Y對X1，X2，X3，X4的最佳線性模型.

隨著國內(nèi)賽事經(jīng)濟的紅火，體育賽事轉(zhuǎn)播權(quán)這一“新興事物”引起了業(yè)界內(nèi)外人士的高度關(guān)注。近有咪咕視頻和優(yōu)酷網(wǎng)從央視手中高價購得2018年世界杯的新媒體轉(zhuǎn)播權(quán)；遠有體奧動力體育傳播有限公司斥資80億購買5年的“中超版權(quán)”。然而本文細究后發(fā)現(xiàn)，無論是對體育賽事轉(zhuǎn)播權(quán)的界定，還是它的保護方式都眾說紛云。換言之，體奧動力等公司以80億元天價所購得的究竟是什么東西，是否屬于法律意義上的“權(quán)利”，在目前的法律語境中尚未有定論。故本文希望厘清：體育賽事轉(zhuǎn)播權(quán)并非局限于知識產(chǎn)權(quán)領(lǐng)域的權(quán)利；它的法律保護路徑需要在更為宏觀的視野下才能繪制成型。

1.13 肝癌H22荷瘤小鼠血液指標的測定

與陰性對照組比較，各給藥組細胞凋亡率顯著升高（＜0.01，表2、圖2），PNS對肝癌H細胞凋亡作用呈濃度和時間依賴性，800 μg/mL、作用48 h 凋亡率達92.77%。

1.14 肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的測定

小鼠脾淋巴細胞的制備：無菌條件下分離小鼠脾臟，剔除脂肪和結(jié)締組織，置于盛有適量無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用玻片研碎，經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 r/min離心10 min，加入3倍體積紅細胞裂解液，置冰上裂解10 min后，1000 r/min離心10 min后棄上清液，RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌離心細胞2次，用2 mL完全培養(yǎng)液重懸，計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞數(shù)為3×10/mL。

該替換，講ω=0映射到ω=±∞，反之亦然；截止發(fā)生在低通截止頻率。即轉(zhuǎn)換了電容與電感，串聯(lián)電感用電容表示，并聯(lián)電容由電感替代。新的元件值為：

在給藥的第7 天，每只小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞0.2 mL進行致敏，并繼續(xù)給藥。連續(xù)免疫4 d，末次給藥后，禁食不禁水12 h，摘除小鼠的眼球，取血于離心管內(nèi)，放置約1 h，4 ℃，4000 r/min，離心10 min，收集血清。另于試管內(nèi)依次加入經(jīng)稀釋100倍的1 mL血清、10%SRBC 0.5 mL、1 mL 10%補體。用相同體積的生理鹽水代替血清樣品，制備空白對照。搖勻試管中的溶液后，置37 ℃水浴中保溫30 min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，2000 r/min，離心10 min，吸取上清液200 μL于96孔透明板，用酶標儀測定值。

1.15 肝癌H22荷瘤小鼠生存期的測定

各組小鼠最后任其自然死亡，觀察記錄小鼠狀態(tài)及死亡情況，計算各組荷瘤小鼠平均存活天數(shù)和生命延長率。生命延長率（%）=（實驗組平均存活時間-對照組平均存活時間）/對照組平均存活時間×100%。

1.16 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)性的以均數(shù)±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNS對肝癌H22細胞的增殖抑制作用

PNS呈濃度依賴性抑制肝癌H細胞的增殖，濃度為600 μg/mL，作用48 h時抑制率高達91.22%，作用效果明顯（＜0.01，表1、圖1）。

2.2 PNS對肝癌H22細胞凋亡的影響

末次給藥后，禁食不禁水12 h，剪除小鼠右邊的胡須，摘除眼球取血0.5 mL，儲存于EDTA-K抗凝管，用XT-2000i型全自動血細胞分析儀測血常規(guī)。

進一步加強對于牧區(qū)牧民的知識培訓(xùn)和教育，提高牧民對于牦牛的飼養(yǎng)和管理水平，減少由于疫苗免疫失敗和對于牦牛的生存環(huán)境不重視以及飼養(yǎng)不合理而出現(xiàn)的病毒感染，最大程度上減少不必要的疫病風(fēng)險。

2.3 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力的影響

與模型組相比，PNS低、中、高各組的單核-吞噬指數(shù)均增加，且PNS 中、高組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；CTX組吞噬指數(shù)低于正常組（＜0.05，表3），與CTX組相比，PNS低、中、高+CTX組吞噬指數(shù)增加，且PNS中、高+CTX組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。

2.4 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

α=K×體質(zhì)量/（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）；K=（Lg-Lg）/（T-T）

2.5 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠免疫細胞因子的影響

與模型組相比，PNS低、中、高劑量組的TNF-α水平增加，PNS 低劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），PNS 中、高劑量組TNF-α水平顯著增加（＜0.01）；與CTX 組相比，PNS+CTX 組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），且PNS中、高+CTX組水平顯著增加（＜0.01）。與模型組相比，PNS低、中、高劑量組的IL-2水平增加，且PNS中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與CTX組相比，聯(lián)合各組的IL-2水平增加，PNS中、高劑量+CTX組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，表5）。

2.6 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠血清溶血素含量的影響

與模型組比較，PNS低、中、高各組血清中溶血素抗體含量升高，促進抗體的生成；與CTX組比較，PNS低、中、高+CTX各組的血清溶血素抗體水平升高，且PNS高+CTX組具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05，表6）。

4)用電運行成本是否交優(yōu)：例如工業(yè)鍋爐需要高溫以利用，通過比較發(fā)現(xiàn)利用電能的成本和用煤炭的成本相比還是較高。但是通過相關(guān)技術(shù)突破、能源枯竭以及電力市場發(fā)展，用電代替煤炭會有經(jīng)濟優(yōu)勢。

2.7 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠血液指標的影響

與模型組相比，CTX組中白細胞、淋巴細胞、紅細胞數(shù)量減少（＜0.05，＜0.01），PNS低、中、高劑量組白細胞、淋巴細胞、紅細胞數(shù)量增加，且PNS高劑量中白細胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與CTX組相比，PNS低、中、高+CTX各組白細胞數(shù)量增加（＜0.05，表7），淋巴細胞、紅細胞數(shù)量也有所增加。

2.8 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響

與模型組相比，PNS 低劑量組的瘤重降低（＜0.05），其他各組的瘤重均顯著降低（＜0.01）；與CTX組相比，PNS低、中、高+CTX組的瘤重均顯著降低，呈劑量依賴性（＜0.01，表8，圖3）。

2.9 PNS和PNS+CTX對肝癌H22荷瘤小鼠生存期的影響

與模型組相比，PNS低劑量組能延長肝癌H荷瘤小鼠的生存期（＜0.05），其他各組荷瘤小鼠的生存期均明顯延長（＜0.01）；聯(lián)合給藥各組的生存期均比單用兩藥的高，且其中PNS 高+CTX 組荷瘤小鼠生存期與CTX組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05，表9，圖4）。

3 討論

肝癌治療效果較差，大多數(shù)肝癌患者診斷時已為中晚期，錯過了最佳手術(shù)治療時期，化療仍然是中晚期肝癌治療的重要方式之一。化療藥作為癌癥的治療藥物，有嚴重的毒副作用，如化療藥CTX對骨髓、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肝、腎等毒副作用大，甚至直接或間接導(dǎo)致患者死亡。中藥治療癌癥具有毒副作用小、提高免疫力、減輕放化療副作用、延長生存期等特點，對肝癌患者的治療具有重要意義。

PNS對肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7404細胞都有抑制及促進凋亡的作用。實驗發(fā)現(xiàn)PNS也能抑制肝癌H細胞的增殖和促進其凋亡（＜0.01），PNS體外具有明顯的抗肝癌作用，馮曉異等的結(jié)果與本實驗的一致。

PNS能增強機體免疫力，從而達到抗肝癌作用。單核-巨噬細胞是機體質(zhì)量要的免疫細胞，能反應(yīng)機體的非特異免疫力強弱。通過碳廓清實驗考察PNS對單核-巨噬細胞吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠單核-巨噬細胞吞噬速率，PNS聯(lián)合CTX的單核-巨噬細胞的吞噬速率優(yōu)于單用CTX（＜0.05），PNS能改善CTX對機體的非特異性免疫損傷。PNS能促進肝癌H荷瘤小鼠脾淋巴細胞的增殖，聯(lián)合給藥各組的脾淋巴細胞的增殖能力也比單用CTX的高（＜0.05），增強細胞免疫能力。PNS與CTX聯(lián)用能刺激S荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖。同時發(fā)現(xiàn)PNS可促進肝癌H荷瘤小鼠血清溶血素抗體的產(chǎn)生，聯(lián)合給藥各組的血清溶血素抗體水平也比單用CTX的高（＜0.05），PNS能改善CTX對機體的體液免疫的損傷。PNS能增加S荷瘤小鼠TNF-α和IL-2的水平，從而參與機體免疫調(diào)節(jié)。實驗表明PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠TNF-α和IL-2的水平，且聯(lián)合給藥各組的TNF-α和IL-2的水平比單用CTX的高（P＜0.05），PNS能刺激細胞因子的釋放參與免疫調(diào)節(jié)。PNS和PNS聯(lián)合CTX均增加肝癌H荷瘤小鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、紅細胞的數(shù)量，保護血液系統(tǒng)。最后，發(fā)現(xiàn)PNS和PNS聯(lián)合CTX能抑制肝癌H荷瘤小鼠腫瘤的生長和延長肝癌H荷瘤小鼠的生存期，聯(lián)合用藥具有更加的治療效果，其中PNS高劑量+CTX 組抑瘤率高達83.28%（＜0.01）、生命延長率達131.25%（＜0.05）。

綜上，實驗首次從免疫的角度研究PNS對肝癌H荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明PNS可提高肝癌H荷瘤小鼠的非特異性和特異性免疫力，從而達到抗腫瘤作用、延長肝癌H荷瘤小鼠生存期。首次考察PNS聯(lián)合CTX聯(lián)用對肝癌H荷瘤小鼠的治療作用，結(jié)果表明聯(lián)合用藥能改善CTX對機體非特異性和特異性免疫力的損傷，減輕CTX的不良反應(yīng)，增強其抗腫瘤效果、延長生存期，有明顯的增效減毒作用，PNS與化療藥聯(lián)用于肝癌患者具有良好應(yīng)用前景和研究價值。