由于缺乏血管、神經(jīng)和淋巴組織，關(guān)節(jié)軟骨自我修復(fù)的能力受到限制。一旦受損，就會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。迄今為止，盡管目前已取得很多進(jìn)展，但是完全再生透明軟骨以及恢復(fù)其原有的機(jī)械特性仍然是一個(gè)難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。免疫反應(yīng)越來(lái)越被認(rèn)為是影響軟骨修復(fù)的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究表明巨噬細(xì)胞在生長(zhǎng)板損傷后的炎癥期中占主導(dǎo)作用。巨噬細(xì)胞主要包括炎性巨噬細(xì)胞M1型和修復(fù)型巨噬細(xì)胞M2型。軟骨在損傷后巨噬細(xì)胞被激活成M1型浸潤(rùn)到損傷局部，并分泌大量促炎癥因子（如TNF-α、IL-1β等），這些炎癥因子可持續(xù)存在，加速了軟骨基質(zhì)的降解。此外，在炎癥微環(huán)境中，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生異常分化，軟骨細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)化或去分化為成纖維樣細(xì)胞，形成機(jī)械性能差的纖維軟骨。在修復(fù)期，M2巨噬細(xì)胞可分泌抗炎因子和軟骨細(xì)胞因子，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨修復(fù)。因此，軟骨再生需要對(duì)關(guān)節(jié)炎癥微環(huán)境進(jìn)行多維時(shí)空調(diào)節(jié)，在炎癥階段促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，將有利于軟骨再生。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）已被證明具有免疫調(diào)節(jié)特性和對(duì)組織具有修復(fù)作用通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。并且研究表明MSCs的抗炎作用是由于其旁分泌機(jī)制，主要涉及外泌體的分泌。外泌體是直徑30～200 nm的由細(xì)胞分泌的囊泡，功能類似于親代間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，外泌體相對(duì)與細(xì)胞來(lái)說(shuō)較容易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，可以避免細(xì)胞移植的許多限制，包括免疫原性和致瘤性。外泌體攜帶各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各種非編碼RNA，特別是miRNA，它們通過(guò)調(diào)控受體細(xì)胞的活性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。然而，單純的外泌體治療在體內(nèi)的治療效果有限，主要由于外泌體局部濃度以及一過(guò)性的釋放而無(wú)法保證持續(xù)的作用。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的3D支架充當(dāng)有效的載體。甲基丙烯酸改性的明膠（GelMA）在某些性質(zhì)上與天然ECM相似，具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的物理性質(zhì)，在眾多組織工程領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用，包括骨骼、軟骨和心臟組織工程等。以GelMA為基材的水凝膠可以作為外泌體的理想載體在神經(jīng)損傷、小兒生長(zhǎng)板損傷等領(lǐng)域已得到證實(shí)，而在軟骨損傷中卻很少有報(bào)道。本研究中，我們旨在體外將甲基丙烯酸改性的明膠水凝膠（GelMA）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來(lái)源的外泌體結(jié)合，通過(guò)抑制炎癥以及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)。我們?cè)u(píng)估了負(fù)載外泌體水凝膠的理化性質(zhì)、細(xì)胞生物相容性以及對(duì)于巨噬細(xì)胞的影響通過(guò)體外共培養(yǎng)系統(tǒng)研究了通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2型極化對(duì)于損傷軟骨細(xì)胞的作用，并且通過(guò)大鼠軟骨損傷模型評(píng)估了負(fù)載外泌體的水凝膠對(duì)軟骨損傷修復(fù)的作用。

作為國(guó)家各級(jí)各類教育機(jī)構(gòu)與組織的體系及其管理規(guī)則，教育制度呈現(xiàn)出“義務(wù)教育年限的延長(zhǎng)、普通教育與職業(yè)教育的綜合化、高等教育的大眾化、終身教育體系的建構(gòu)”[7]等改革趨勢(shì)。“深化教育改革”是習(xí)近平新時(shí)代中國(guó)特色社會(huì)主義教育制度論的核心關(guān)鍵詞[8]。十八屆三中全會(huì)提出要“深化教育領(lǐng)域綜合改革”，將綜合改革作為當(dāng)前我國(guó)教育改革與發(fā)展的重要任務(wù)。“十三五”規(guī)劃首次明確將“提高教育質(zhì)量”作為未來(lái)5年教育工作的重點(diǎn)任務(wù)。習(xí)近平對(duì)深化教育改革提出了明確要求 [9]，貫穿了從基礎(chǔ)教育到職業(yè)教育到高等教育等整個(gè)階段，涵蓋了從家庭教育到學(xué)校教育到社會(huì)教育等全部領(lǐng)域。

1 材料和方法

1.1 軟骨細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的獲取

軟骨細(xì)胞是從2周齡SD大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中按既定方法獲得。SD大鼠從南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)。收集的軟骨細(xì)胞在加入10%FBS（Gibco）、100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素（Gibco）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）/F-12 培養(yǎng)基（Gibco）中在5%CO、37 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔1 d 更換1 次，我們使用第2 代到第4 代的細(xì)胞。RAW264.7細(xì)胞取自ATCC細(xì)胞庫(kù)并在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和鑒定

根據(jù)之前研究，通過(guò)沖洗2周大鼠脛骨和股骨的骨髓腔獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放在含10%血清的低糖DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中，并在37 ℃，5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。3～5代（P3-P5）的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。分別使用成骨和成脂分化培養(yǎng)基對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，使用茜素紅染色、油紅O染色驗(yàn)證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多細(xì)胞系分化潛力。

將獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在添加10%無(wú)外泌體血清的低糖DMEM（Gibco）中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合達(dá)到50%～60%后，收集上清液進(jìn)行超速離心。首先，將上清液以300、3000、10 000離心10 min，以分離活/死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后，在100 000離心90 min后，在離心管底部的外泌體用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）重懸并儲(chǔ)存在-80 ℃。以上所有離心過(guò)程均在4 ℃下進(jìn)行。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的分離、鑒定以及染色

2.2比較兩組患兒外漏、低血糖、皮下沉積等并發(fā)癥發(fā)生情況,具體情況(見(jiàn)表2),實(shí)驗(yàn)組共有3例患兒發(fā)生并發(fā)癥,對(duì)照組共有7例患兒發(fā)生并發(fā)癥,實(shí)驗(yàn)組患兒并發(fā)癥發(fā)生率均明顯低于對(duì)照組。

收集到的外泌體通過(guò)表面標(biāo)記抗體進(jìn)行鑒定，包括CD9（ProteinTech）和TSG101（Abcam）。分別使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米粒子跟蹤分析（qNanosystem,Izon Science）觀察形態(tài)和尺寸分布。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用紅色熒光染料PKH26（Sigma-Aldrich）進(jìn)行外泌體染色。

通過(guò)甲基丙烯酸改性明膠前后的H核磁共振譜圖，發(fā)現(xiàn)MA改性明膠（GelMA）在5.3 ppm 和5.5 ppm 新出現(xiàn)了兩個(gè)屬于甲基丙烯酰胺（MA）的質(zhì)子峰（圖2A）。流變性能測(cè)試表明，GelMA-Exo 的儲(chǔ)能模量（G’）遠(yuǎn)大于損耗模量（G”），并且它的儲(chǔ)存模量為1525±50 Pa（圖2B）。SEM成像結(jié)果顯示水凝膠呈多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且外泌體結(jié)合在GelMA水凝膠內(nèi)表面（圖2C）。外泌體的釋放持續(xù)了14 d，超過(guò)80%的外泌體從水凝膠中釋放（圖2D～E）。

1.4 外泌體-水凝膠體系的構(gòu)建

在50 ℃下將稱取的5 g明膠（Gel，Sigma-Aldrich）加入到50 mL PBS溶液中，進(jìn)行攪拌直至明膠完全溶解。然后量取4 mL 的甲基丙烯酸酐（MA，Sigma-Aldrich）以0.5 mL/min的速度緩慢滴加到明膠溶液中，在以上條件下磁力攪拌連續(xù)反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)。隨后將溶液置入透析袋（12 000～14 000）中，在50 ℃下的純水中進(jìn)行透析6 d。將透析后的溶液在2000 r/min下進(jìn)行離心10 min，取上層清液，在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干6 d，最終得到泡沫狀的甲基丙烯酸改性明膠樣品（GelMA）。將GelMA在50 ℃下溶解在重水（DO）中，采用核磁共振譜儀進(jìn)行驗(yàn)征是否改性成功。將凍干的GelMA 溶解于濃度為0.5%()的光引發(fā)劑Irgacure 2959（Sigma-Aldrich）溶液中，制備成濃度為10%()的單體預(yù)聚溶液。將200 μg外泌體與60 μL水凝膠溶液充分混合，在紫外輻射（6.9 mW/cm2，360～480 nm）下聚合15 s以獲得外泌體-水凝膠體系（GelMA-Exo）。

1.5 材料表征

研究揭示了在不同的企業(yè)生命周期階段，碳信息披露對(duì)企業(yè)融資約束的影響存在差異化。啟示企業(yè)在努力構(gòu)建全面規(guī)范的碳信息披露體系的同時(shí)，應(yīng)結(jié)合企業(yè)所處的生命周期，做好企業(yè)碳信息披露的戰(zhàn)略規(guī)劃安排，以實(shí)現(xiàn)企業(yè)價(jià)值在不同生命周期階段的最大化。

1.6 外泌體釋放曲線的測(cè)定

根據(jù)之前的研究，使用雙茚二酮酸(BCA)試劑盒（Beyotime）評(píng)估累積釋放和每日釋放情況。將上述制備的GelMA-Exo 在37 ℃條件下在PBS 溶液中孵育。在第1、3、7、14天收集上清，使用BCA法進(jìn)行游離外泌體的檢測(cè)，外泌體總量減去上清液中游離外泌體的量就是水凝膠負(fù)載的外泌體的總量。

鋁合金的納標(biāo)重點(diǎn)是：高純鋁合金材料及其相應(yīng)成套的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)。高純鋁合金材料對(duì)鋁合金的成分控制的非常嚴(yán)格，使得合金的疲勞度、斷裂性能以及抗腐蝕性能都有明顯提高，因此它是飛機(jī)采用損傷容限設(shè)計(jì)及可靠性設(shè)計(jì)的理想化材料，也是航空鋁合金的主要發(fā)展方向。鋁合金的預(yù)拉伸板、鍛件規(guī)范、擠壓管材等國(guó)家軍用標(biāo)準(zhǔn)的制定，為飛機(jī)重要主承力結(jié)構(gòu)零件的制造提供了原材料的保障，進(jìn)而滿足了飛機(jī)批量生產(chǎn)的需要。目前我國(guó)飛機(jī)發(fā)動(dòng)機(jī)制造過(guò)程中直接使用GJB的鋁合金標(biāo)準(zhǔn)，鋁合金的棒、線、管材使用GB。而對(duì)于鎂合金的GB，實(shí)際運(yùn)用在制造、生產(chǎn)鋼棒與鑄造合金中。

1.7 外泌體的攝取

為證實(shí)水凝膠中含有的外泌體可被細(xì)胞吞噬，將RAW264.7細(xì)胞與GelMA-Exo共培養(yǎng)24 h。24 h后，吸取出培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min。激光共聚焦顯微鏡（Leica）下免疫熒光（IF）染色觀察外泌體的吞噬情況（細(xì)胞骨架用Actin-Tracker Green 染色（Beyotime），細(xì)胞核用Hoechst 33342染色（Beyotime））。

1.8 材料生物相容性評(píng)價(jià)

進(jìn)行體外生物相容性實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞活力、增殖和粘附實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)行活/死染色試驗(yàn)，將密度為1×10的軟骨細(xì)胞種植在12孔培養(yǎng)板上，與各組材料共培養(yǎng)24 h，然后以1 mL∶3 μL∶5 μL（PBS:calcein-AM（Invitrogen）∶PI（Invitrogen））的比例制備活/死液，每組加入，并且在37 ℃下孵育30 min后激光顯微鏡觀察。將1×10軟骨細(xì)胞分別與各組軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、7 d后，分別加入100 μl/mL 的CCK-8溶液（Beyotime）培養(yǎng)2 h。然后在96孔板上加入100 μL 上清液，用酶標(biāo)儀（BioTech）測(cè)定吸光度。最后用以下方法檢測(cè)細(xì)胞與水凝膠的粘附性：簡(jiǎn)單地說(shuō)，密度為1×10/孔的細(xì)胞培養(yǎng)3 d，用4%的多聚甲醛固定，用Actin-Tracker Green和Hoechst 染色，并用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.9 GelMA-Exo/RAW264.7細(xì)胞/軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

為了檢測(cè)系統(tǒng)免疫微環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，用Transwell室（ThermoFisher）建立了GelMA-Exo/RAW264.7細(xì)胞/軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)前用IL-1β（10 ng/mL）處理軟骨細(xì)胞24 h。GelMA-Exo與1×10RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，置于下室，1×10軟骨細(xì)胞置于上室。1.0 μm孔徑的聚碳酸酯膜將兩層膜隔開(kāi)，不影響細(xì)胞因子的自由通過(guò)。

在經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新形勢(shì)下，涉農(nóng)企業(yè)面臨的內(nèi)外部環(huán)境發(fā)生著改變，這就要求企業(yè)能夠適時(shí)調(diào)整并優(yōu)化完善公司治理結(jié)構(gòu)，在加強(qiáng)黨的領(lǐng)導(dǎo)下提高涉農(nóng)企業(yè)公司治理的自主創(chuàng)新能力，提升治理效率，從而實(shí)現(xiàn)涉農(nóng)企業(yè)穩(wěn)定發(fā)展，助推我國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化實(shí)現(xiàn)、農(nóng)村繁榮和農(nóng)民增產(chǎn)增收。

1.10 基因表達(dá)測(cè)定

GelMA組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖5A）。GelMA-Exo組和Exo組顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞的COL-2和SOX-9水平，下調(diào)MMP-13的表達(dá)（＜0.05,圖5A）。q-PCR結(jié)果還顯示GelMA-Exo組在第7天的治療效果明顯優(yōu)于Exo組（＜0.05，圖5A）。免疫熒光染色分析與q-PCR結(jié)果一致，GelMA-Exo組COL-2蛋白表達(dá)最高，而MMP-13蛋白表達(dá)最低（＜0.05，圖5B～C）。

利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM,ZEISS）觀察了水凝膠的內(nèi)部形貌和結(jié)構(gòu)。用安東帕MCR 301流變儀在恒定應(yīng)變（5%）對(duì)水凝膠進(jìn)行頻率掃描，掃描頻率為0.1～10 Hz，以檢測(cè)水凝膠材料的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）。

1.11 Western blotting檢測(cè)

細(xì)胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher）的RIPA緩沖液（CWBIO）中研磨成勻漿。上清液在冰上裂解30 min，在4 ℃下12 000 r/min離心30 min收集。用BCA試劑盒（Beyotime）測(cè)定總蛋白濃度。將等量（40 μg）的蛋白上載于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF,Thermo Fisher）膜上，用5%脫脂乳封閉PVDF膜1 h，然后用一抗孵育過(guò)夜（表2）。然后將PVDF膜與二抗孵育1 h，然后應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（Thermo Fisher）進(jìn)行。在每一步之前，使用TBST緩沖鹽水清洗膜3次。使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.12 免疫熒光檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行Tukey 檢驗(yàn)的單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.13 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型的構(gòu)建

12 只8 周齡雌性SD 大鼠分為4 組，即假手術(shù)組（Sham）、單純損傷組（SI）、GelMA 組和GelMA-Exo組。首先，分別使用腹腔注射吡嗪（6 mg/kg）和氯胺酮（70 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，左腿刮毛，用碘伏徹底消毒。在無(wú)菌條件下切開(kāi)內(nèi)側(cè)髕骨皮膚和肌肉暴露股骨髁。隨后，使用15 g針沿股骨縱軸鉆一個(gè)直徑2 mm的孔，使其損傷表面軟骨。每只老鼠經(jīng)處理后，縫合切口并再次消毒。然后把老鼠關(guān)在單獨(dú)的籠子里，讓它們自由地獲得食物和水。術(shù)后4周對(duì)所有大鼠實(shí)施安樂(lè)死。

1.14 組織學(xué)評(píng)價(jià)

治療4周后處死大鼠，采集關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本。組織用多聚甲醛固定24 h，在10%EDTA（pH 7.4）中脫鈣21 d后，進(jìn)行石蠟包埋、切片。切片在二甲苯中脫蠟，通過(guò)一系列分級(jí)的乙醇洗滌再水化后，使用蘇木精和伊紅（H&E）以及Masson染色評(píng)估軟骨修復(fù)情況。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先樣品用4%多聚甲醛在PBS 中固定30 min。然后，用0.2%Triton X-100（Biofroxx）處理細(xì)胞或組織10 min，在室溫下用3%牛血清白蛋白（BSA，Biofroxx）封閉1 h，最后加入一抗在4 ℃條件下過(guò)夜。此后，樣品用PBS 洗滌3次，室溫下與二抗孵2 h，并進(jìn)行Hoechst（Beyotime）染色。最后，在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。相關(guān)抗體列在表2中。

2 結(jié)果

2.1 骨髓干細(xì)胞及其外泌體表征

在光學(xué)顯微鏡下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)為典型的紡錘體形態(tài)（圖1A）。用茜素紅、油紅染色表明提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多細(xì)胞系分化潛力（圖1B）。通過(guò)透射電鏡觀察，其形態(tài)為圓形或橢圓形，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整（圖1C）。粒徑分析表明直徑主要集中在89 nm 左右，與外泌體的粒徑分布一致（圖1D）。蛋白免疫印跡結(jié)果分析表明，納米粒子表達(dá)了外泌體特異性標(biāo)記CD9和TSG101（圖1E）。

2.2 材料的合成與表征

β2-MG是由淋巴細(xì)胞或者其他有核細(xì)胞分泌一種內(nèi)源性低分子量血清蛋白質(zhì)。血清中的99.9%的β2-MG會(huì)被近曲小管細(xì)胞重吸收和降解，不再向血液中反流，以此保持β2-MG在體內(nèi)的恒定。但當(dāng)近曲小管輕度受損時(shí)，尿液中β2-MG會(huì)顯著增加[7]，可見(jiàn)人體腎臟的損傷程度與β2-MG具有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.3 生物相容性評(píng)估

活/死染色顯示各組均可見(jiàn)大量活細(xì)胞（綠色），少量死細(xì)胞（紅色）（圖3A）。CCK-8分析結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞增殖隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在第3天和第7天，GelMA-Exo和Exo組軟骨細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組和GelMA組（＜0.05，圖3B）。細(xì)胞骨架成像顯示，各組的軟骨細(xì)胞都具有較大的擴(kuò)張面積（圖2C）。

2.4 GelMA-Exo促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化

裝載在GelMA 水凝膠上的外泌體能夠被RAW264.7細(xì)胞吞噬并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用（圖4A）。第3天，q-PCR結(jié)果顯示，M2表型標(biāo)記（Arg-1和IL-10）在GelMA-Exo組和Exo組的表達(dá)值顯著高于對(duì)照組（＜0.05，圖4B）。而GelMA組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖4B）。在第7天時(shí)，q-PCR結(jié)果顯示GelMAExo顯著提高了Arg-1和IL-10的表達(dá)水平，而iNOS和TNF-α的表達(dá)水平降低（＜0.05，圖4B）。與q-PCR分析一致，第7天免疫熒光結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，GelMAExo組iNOS陽(yáng)性細(xì)胞比例較低，而Arg-1陽(yáng)性細(xì)胞比例較高（＜0.05，圖4C～D）。

2.5 GelMA-Exo通過(guò)改善免疫微環(huán)境促進(jìn)IL-1β?lián)p傷的軟骨細(xì)胞的修復(fù)

首先使用一種RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA（Omega），然后使用EVO MLV RT試劑盒將其（Accurate Biotechnology）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR分析。內(nèi)參選擇GAPDH。用2法測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量。分別進(jìn)行了3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。引物序列見(jiàn)于表1。

2.6 GelMA-Exo明顯促進(jìn)大鼠軟骨損傷的修復(fù)

動(dòng)物模型建立4周后，采集動(dòng)物膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行HE和Msaaon染色（圖6）。染色顯示假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨清晰，表面光滑完整。單純損傷組關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)域出現(xiàn)較大的軟骨缺損、斷裂，基本很少有再生的軟骨。相比于單純損傷組，GelMA組和GelMA-Exo組修復(fù)效果良好，且GelMA-Exo組修復(fù)效果大于GelMA組。

我國(guó)古籍浩如瀚海，不可斗量，屬于地名專著的卻寥如晨星，含有地名內(nèi)容的絕大多數(shù)信息散落于各種古代文選中，至于地名命名原則更是大海撈針，然而正是由于陳橋驛先生的深入探求，才確立了我國(guó)古代著作中出現(xiàn)的地名命名原則。

3 討論

研究認(rèn)為軟骨損傷所產(chǎn)生的炎癥環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞的死亡和肥大、細(xì)胞外間質(zhì)破裂、異位骨形成以及軟骨損傷進(jìn)展到骨關(guān)節(jié)炎是至關(guān)重要的。M1巨噬細(xì)胞及其分泌的炎癥因子能抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、活性以及軟骨分化，從而加速ECM 的降解。研究表明CD14巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子能抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜衍生干細(xì)胞（SDSC）向軟骨分化，并且他們發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α顯著抑制SDSCs 中軟骨形成基因的表達(dá)。mTORC1通過(guò)驅(qū)動(dòng)M1巨噬細(xì)胞的極化來(lái)促進(jìn)肥大軟骨細(xì)胞的發(fā)育和成熟。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明M1巨噬細(xì)胞不利于軟骨修復(fù)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化將有利于軟骨損傷的修復(fù)。

本文考慮到主客觀賦權(quán)法存在的缺點(diǎn)與不足，立足于主客觀結(jié)合賦權(quán)方法的現(xiàn)狀，采用層次分析法與熵權(quán)法相結(jié)合的賦權(quán)方法，確定了汾河流域節(jié)水灌溉水平綜合評(píng)價(jià)體系中各個(gè)指標(biāo)的綜合權(quán)重，將專家的經(jīng)驗(yàn)知識(shí)和各個(gè)數(shù)據(jù)信息充分結(jié)合，既體現(xiàn)了專家的個(gè)人意向，實(shí)現(xiàn)了專家個(gè)人偏好的合理表達(dá)，又能反映指標(biāo)的客觀特性，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性?？蔀橄嚓P(guān)評(píng)價(jià)體系指標(biāo)權(quán)重的確定提供參考。

外泌體攜帶各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各種非編碼RNA，特別是miRNA，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，BMSCs來(lái)源的外泌體已被證明可以誘導(dǎo)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白激酶B通路的快速磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，與CCK8結(jié)果一致。有學(xué)者將骨髓干細(xì)胞來(lái)源的外泌體注射到大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)用于緩解關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。然而，骨髓干細(xì)胞外泌體是否可以通過(guò)調(diào)控免疫而促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)卻很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用GelMA水凝膠聯(lián)合骨髓干細(xì)胞來(lái)源外泌體，用于軟骨損傷的治療。材料學(xué)表征表明我們成功合成了GelMA水凝膠，是一個(gè)穩(wěn)定的粘彈性固體，彈性模量滿足體內(nèi)應(yīng)用的條件，并且外泌體成功負(fù)載到GelMA水凝膠上。GelMA水凝膠在某些性質(zhì)上與天然ECM相似，具有良好的生物相容性，可充當(dāng)外泌體的理想載體，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。GelMA水凝膠的多孔表面和親水特性也有利于細(xì)胞粘附。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明GelMA水凝膠也能促進(jìn)軟骨的修復(fù)，這可能歸功于它的ECM成分。外泌體在GelMA水凝膠內(nèi)釋放持續(xù)了14 d，且超過(guò)80%的外泌體從水凝膠中釋放出來(lái)，這確保了最佳的生物治療效果。相比于外泌體一過(guò)性的釋放，水凝膠的緩釋作用能使外泌體長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮生物學(xué)功能。將RAW 細(xì)胞與不同樣品共培養(yǎng)，Exo 組和GelMA-Exo組在第3天沒(méi)有差異而第7天出現(xiàn)差異，表明緩釋的外泌體具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。

在軟骨損傷過(guò)程中，靜息的巨噬細(xì)胞可被刺激分化為M1和M2亞群，M1亞群主要參與炎癥的早期階段，而M2亞群主要參與修復(fù)階段。M1巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體蛋白和Toll樣受體蛋白可識(shí)別關(guān)節(jié)腔內(nèi)的損傷相關(guān)分子模式，激活NF-κB 信號(hào)通路，從而促進(jìn)炎癥因子的釋放。本研究表明負(fù)載外泌體的GelMA水凝膠可以有效抑制iNOS和TNF-α的表達(dá)，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2轉(zhuǎn)化。根據(jù)我們先前的研究，外泌體內(nèi)所含的各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及非編碼RNA，特別是miR-199a，它可以通過(guò)抑制NF-κB 通路來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能。

進(jìn)一步我們通過(guò)建立Transwell 共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)負(fù)載外泌體的GelMA水凝膠能夠通過(guò)調(diào)控免疫進(jìn)而促進(jìn)SOX-9 和COL-2 的表達(dá)，而抑制MMP-13 的表達(dá)。SOX-9被認(rèn)為是軟骨形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，可以調(diào)節(jié)軟骨形成相關(guān)標(biāo)志物（II型膠原）的表達(dá)和GAG 基質(zhì)的形成。M1型巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α和IL-1β等促炎因子可以通過(guò)降低炎癥環(huán)境中軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子SOX9 mRNA的水平來(lái)抑制軟骨形成基因的表達(dá)。此外，炎癥免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子如IL-1β、iNOS 和TNF-α?xí)?dǎo)致基質(zhì)蛋白酶如MMP-1和MMP-13過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解。M2巨噬細(xì)胞，也稱為創(chuàng)傷修復(fù)巨噬細(xì)胞，其分泌的許多抗炎分子，包括Arg-1、IL-10等，為軟骨細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)造了一個(gè)必要的抗炎環(huán)境，抑制了MMP-13的表達(dá)，從而促進(jìn)了損傷軟骨細(xì)胞的修復(fù)。

綜上，本研究將骨髓干細(xì)胞來(lái)源的外泌體負(fù)載到GelMA水凝膠上，體外實(shí)驗(yàn)表明負(fù)載在水凝膠上的外泌體可以通過(guò)抑制炎癥并且可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M2極化來(lái)減輕炎癥對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用，從而促進(jìn)軟骨ECM的合成。同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明負(fù)載外泌體的GelMA有利于大鼠軟骨損傷的修復(fù)。本研究將有望為臨床治療軟骨損傷提供一種新思路。