肺癌為全球致死率排名第一的惡性腫瘤。近年來，肺癌的診斷、治療技術(shù)取得了較大進(jìn)展，但肺癌病人5年的存活期仍低于18%。研究肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制將為肺癌的診斷及治療提供新的線索。同源盒蛋白B13（HOXB13）是一類前列腺譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子。截至目前，關(guān)于HOXB13的研究均在前列腺癌中，在其他癌癥中的研究還較少。據(jù)報(bào)道，肺癌中HOXB13異常高表達(dá)，促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移，而HOXB13對肺癌細(xì)胞增殖的影響還未見報(bào)道，還需深入研究肺癌中HOXB13對細(xì)胞增殖的影響及其上游調(diào)控機(jī)制。

依據(jù)工程和水文地質(zhì)條件，擬建場區(qū)地處淮河右岸，江淮丘陵北緣，屬丘陵地貌，總體地形南高北低。場區(qū)主要位于采煤塌陷區(qū)內(nèi)的垃圾填埋堆及其周邊，受人工活動影響，地勢高低不平，其中場地內(nèi)的垃圾堆長度約600 m，寬50～150 m，呈不規(guī)則長條形，垃圾堆高度10～20 m，頂高40～48 m，垃圾堆四周地勢較為平坦，多為麥田，總體地勢略由西南向東北傾斜，地面高程34～38m。

miRNAs是一段長度為18～25 bp的非編碼RNA，其參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的多種進(jìn)程（生長、增殖、凋亡和遷移）。而在肺癌中，miRNA調(diào)控HOXB13的研究還未見報(bào)道，因此本研究通過3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測了可能結(jié)合HOXB13的miRNA，分析發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p是其最可能結(jié)合的miRNA。有研究表明，miR-20a-5p在肺癌中抑制了血管的生成，并抑制了肺癌的進(jìn)程。而關(guān)于miR-20a-5p對肺癌細(xì)胞增殖的影響還未見報(bào)道?；谏鲜鲅芯勘尘埃覀兺茰ymiR-20a-5p可能通過調(diào)控HOXB13表達(dá)進(jìn)而抑制了肺癌細(xì)胞的增殖。本文研究了HOXB13對肺癌細(xì)胞增殖的影響，并在體外探討了miR-20a-5p對HOXB13的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株A549、H1299（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

稱取1 g納豆，放入離心管中，加入10 mL蒸餾水，放入離心機(jī)4000 r/min離心10 min取上清液，即粗酶液，將上清液倒入10 mL刻度試管中，即為樣品溶液。

使用SPSS V22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549、H1299 用于含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%的CO，待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HOXB13 過表達(dá)與干擾 HOXB13 siRNA 及HOXB13過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉瑪生物科技有限公司）。將細(xì)胞鋪到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長到60%左右，按照轉(zhuǎn)染試劑（Lipo3000）的 說明書將HOXB13 siRNA 及HOXB13過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。

1.2.2 miR-20a-5p轉(zhuǎn)染 miR-20a-5p過表達(dá)及干擾（廣州銳博生物有限公司）。將細(xì)胞鋪到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長到60%左右，按照轉(zhuǎn)染試劑（Lipo3000）的說明書將等量的miR-20a-5p過表達(dá)及干擾轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。

1.2.4 Western blotting 檢測HOXB13 蛋白表達(dá)情況細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，離心后棄上清。加入RIPA，冰上放置30 min。低溫離心（12 000，10 min），吸取上清。加入5×的蛋白上樣緩沖液，100 ℃，5 min。SDSPAGE電泳（10%）后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（冰浴，300 mA 90 min），隨后開始封閉（5%脫脂奶粉，室溫放置1 h）。最后加入HOXB13 I抗（1∶2000稀釋），4 ℃放置過夜。隨后，將膜取出加入1×TBST清洗3遍（10 min/遍）。清洗結(jié)束后，加入II 抗（1∶2000稀釋），室溫放置1 h，再將膜取出加入1×TBST清洗3遍（10 min/遍）。將洗好的膜放到曝光板上，正面朝上，加入顯影液，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。

60例患者，隨機(jī)分為中藥治療組和西藥治療組?；颊呔?次或3次以上流產(chǎn)史，年齡24～36歲，夫妻雙方染色體檢查正常，無感染性疾病，無先天性生殖系統(tǒng)畸形。兩組患者在年齡構(gòu)成、觀察指標(biāo)等方面比較，無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-20a-5p及HOXB13 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，加入胰酶消化并收集細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書上的方法提取總RNA。通過qRT-PCR法檢測并定量HOXB13 mRNA含量（GAPDH作為內(nèi)參基因）和miR-20a-5p（U6 作為內(nèi)參基因）。HOXB13 和GAPDH引物序列（表1）。數(shù)據(jù)計(jì)算使用2法。

1.2.8 EdU實(shí)驗(yàn) EdU試劑盒用于檢測細(xì)胞增殖情況，檢測轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞的增殖情況。具體步驟為：加入用培液稀釋后的EdU溶液1 mL(培液：EdU溶液=1000∶1），37 ℃放置2 h；棄液體，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛200 μL/孔，固定30 min；棄液體，加入甘氨酸溶液（2 mg/mL）150 μL/孔，常溫放置5 min；PBS清洗3次，加入200 μL/孔含0.5%的TritonX-100滲透液，放置10 min；PBS清洗1次；加入200 μL/孔的Appollo染色液，常溫避光放置30 min；再用滲透液清洗3 遍，10 min/遍；用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色30 min，PBS清洗2次；最后熒光顯微鏡（Olympus BX51）觀察并拍照。

qRT-PCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)HOXB13后HOXB13的表達(dá)量與對照組相比較明顯提高（＜0.05），而轉(zhuǎn)染HOXB13 siRNA 后其表達(dá)量與對照組相比較降低（＜0.05，圖1A～C）。CCK-8試劑盒檢測結(jié)果顯示，HOXB13過表達(dá)組促進(jìn)了肺癌A549細(xì)胞增殖（＜0.05）；而HOXB13干擾后，肺癌A549細(xì)胞增殖受到了抑制（＜0.05，圖1D）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOXB13 過表達(dá)組EdU 陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組（＜0.05）；而HOXB13干擾后，肺癌A549細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組（＜0.05，圖1E、F）。

1.2.7 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況 CCK-8試劑盒用于檢測細(xì)胞增殖情況，檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞4個時間點(diǎn)（0、24、48、60 h）的細(xì)胞活力。細(xì)胞相對增殖活性=（實(shí)驗(yàn)組-空白對照組）/(實(shí)驗(yàn)組-空白對照組)，其中0表示第1個時間點(diǎn)測定值，N表示后面幾個時間點(diǎn)測定值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco）、10%胎牛血清（Sigma）、Lipo3000（Invitrogen）、RNA提取試劑盒（飛捷生物）、CCK-8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（凱基生物）、RIPA 蛋白裂解液（碧云天）、HOXB13 I抗（Abcam）、GAPDH I抗（Santa cruz）、山羊抗兔Ⅱ抗（Santa cruz）、山羊抗鼠Ⅱ抗（Santa cruz）。

2 結(jié)果

2.1 HOXB13促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖

⑧謝開云：《空靈含蓄的時空意象——兩首<釵頭鳳> 比較賞析》，劉建英《淺談陸游與 <釵頭鳳> 的前因后果》。釵頭鳳釵頭鳳

2.2 預(yù)測并驗(yàn)證HOXB13調(diào)控的miRNA是miR-20a-5p

通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出miR-20a-5p 是HOXB13 結(jié)合的miRNA。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-20a-5p是否調(diào)控HOXB13基因的表達(dá)，我們在2種肺癌細(xì)胞中干預(yù)miR-20a-5p的表達(dá)，24h后通過qRT-PCR及Western blot檢測。Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-20a-5p后，細(xì)胞內(nèi)的HOXB13蛋白表達(dá)水平與對照組相比降低；而干擾miR-20a-5p 表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的HOXB13蛋白表達(dá)水平與對照組相比升高（＜0.05，圖2B,C）。qRT-PCR結(jié)果顯示，干預(yù)miR-20a-5p表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的miR-20a-5p發(fā)生了明顯變化（＜0.05，圖2E），且細(xì)胞內(nèi)的HOXB13 mRNA水平變化沒有發(fā)生變化（＞0.05，圖2D）。

2.3 miR-20a-5p抑制了肺癌細(xì)胞的增殖

在肺癌細(xì)胞內(nèi)，干預(yù)miR-20a-5p 表達(dá)后，通過CCK-8試劑盒檢測肺癌細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，miR-20a-5p 過表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞的增殖（＜0.05）。而miR-20a-5p表達(dá)降低后，其細(xì)胞增殖能力增加（＜0.05，圖3A、B）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-20a-5p過表達(dá)組EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組（＜0.05）；而miR-20a-5p干擾后，肺癌A549細(xì)胞EdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組（＜0.05，圖3C、D）。

2.4 miR-20a-5p抑制HOXB13基因表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖

為闡明miR-20a-5p是否通過調(diào)控HOXB13基因的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖，我們在肺癌細(xì)胞中同時過表達(dá)miR-20a-5p及HOXB13，24 h后采用CCK-8法檢測肺癌細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示：同時過表達(dá)miR-20a-5p和HOXB13組對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響位于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-20a-5p過表達(dá)組及單獨(dú)轉(zhuǎn)染HOXB13過表達(dá)組之間，miR-20a-5p的過表達(dá)恢復(fù)了HOXB13基因過表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響（＜0.05，圖4A）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同時過表達(dá)miR-20a-5p和HOXB13組的EdU陽性細(xì)胞比例介于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-20a-5p過表達(dá)組及單獨(dú)轉(zhuǎn)染HOXB13過表達(dá)組之間（＜0.05，圖4B、C）。

3 討論

有研究報(bào)道HOXB13促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移及侵襲；子宮內(nèi)膜癌中HOXB13高表達(dá)，并可以作為一個腫瘤診斷標(biāo)志物；HOXB13 在胃癌中抑制了細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。已有研究表明HOXB13在肺癌中高表達(dá)，且促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移。但關(guān)于HOXB13對肺癌細(xì)胞增殖的影響還未見報(bào)道。因此，本研究首先通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HOXB13促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果也驗(yàn)證了HOXB13可能在肺癌中促進(jìn)了肺癌的進(jìn)程。

1.2.5 生物信息學(xué)分析篩選HOXB13 可能結(jié)合的miRNA 為找出可能調(diào)控HOXB13基因表達(dá)的miRNAs，通過3種不同的生物信息學(xué)軟件（TargetScan、miRanda及PicTar）篩選可能結(jié)合HOXB13的miRNAs。在候選miRNAs中，3種軟件一致預(yù)測miR-20a-5p是HOXB13結(jié)合的miRNA。

miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制調(diào)控靶基因的表達(dá)，在多種腫瘤中發(fā)揮不同的作用。miR-20a-5p在胃癌、鼻咽癌、三陰乳腺癌及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)且促進(jìn)了癌癥的進(jìn)程，而在子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及肝癌中低表達(dá)并可以作為一個抑癌miRNA發(fā)揮作用。截至目前，有關(guān)miR-20a-5p在肺癌中的研究還很少，尤其是miR-20a-5p對肺癌細(xì)胞增殖的研究還未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測并找到可能結(jié)合HOXB13 的miRNA 為miR-20a-5p，通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-20a-5p可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，而抑制miR-20a-5p會促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞增殖。結(jié)果表明miR-20a-5p抑制了肺癌細(xì)胞增殖，這一結(jié)果與HOXB13對肺癌細(xì)胞的增殖影響相反，與前人關(guān)于miR-20a-5p在肺癌中可能作為一個抑癌miRNA發(fā)揮作用的結(jié)果相一致。

綜上，商家主動提供運(yùn)費(fèi)險對大部分消費(fèi)者而言在購買產(chǎn)品時具有正向的引導(dǎo)作用，而對退貨則并非具有較大的負(fù)面影響，退貨費(fèi)用的降低只是影響退貨的眾多因素之一，并非決定性因素。

為驗(yàn)證miR-20a-5p與HOXB13基因是否存在調(diào)控關(guān)系，本研究在肺癌的2個細(xì)胞系中干預(yù)miR-20a-5p的表達(dá)，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)的HOXB13蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-20a-5p 后HOXB13蛋白的表達(dá)水平明顯下降；而干擾miR-20a-5p后HOXB13蛋白表達(dá)水平明顯升高；但HOXB13的mRNA水平卻沒有變化。以上結(jié)果表明，miR-20a-5p在肺癌細(xì)胞中在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HOXB13基因的表達(dá)。

記者今天(9月18日)從最高法獲悉，最高法近日發(fā)布《關(guān)于在司法解釋中全面貫徹社會主義核心價值觀的工作規(guī)劃(2018-2023)》，對未來5年的司法解釋工作做出專門部署。記者注意到，《規(guī)劃》提到，要適時出臺防衛(wèi)過當(dāng)?shù)恼J(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)、處罰原則和見義勇為相關(guān)糾紛的法律適用標(biāo)準(zhǔn)，鼓勵正當(dāng)防衛(wèi)。

為進(jìn)一步的驗(yàn)證在肺癌A549細(xì)胞中miR-20a-5p調(diào)控HOXB1基因表達(dá)，我們在肺癌A549細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-20a-5p過表達(dá)和HOXB13過表達(dá)質(zhì)粒，CCK-8及EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速率介于單獨(dú)過表達(dá)miR-20a-5p組與單獨(dú)過表達(dá)HOXB13組之間，說明細(xì)胞內(nèi)miR-20a-5p過表達(dá)后逆轉(zhuǎn)了HOXB13對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，說明miR-20a-5p通過調(diào)控HOXB13基因的表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HOXB13 可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的增殖，且證明了miR-20a-5p可以抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，并證實(shí)miR-20a-5p可以通過負(fù)調(diào)控HOXB13基因的表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。然而，miR-20a-5p 負(fù)調(diào)控HOXB13 基因表達(dá)具體是怎么影響肺癌細(xì)胞增殖，miR-20a-5p是否可以作為肺癌診斷的一個生物標(biāo)志物，miR-20a-5p與肺癌中小細(xì)胞肺癌、鱗癌是否有關(guān)？這些問題還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。