張?chǎng)╃?，李東娜，馬萌萌，徐楊楊，王少峽，柴麗娟, 3，郭 虹, 3*，胡利民, 3*

注射用丹參多酚酸通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR通路介導(dǎo)的自噬對(duì)氧糖剝奪/再灌注Neuro-2a細(xì)胞凋亡的影響

張?chǎng)╃?，李東娜1，馬萌萌2，徐楊楊1，王少峽1，柴麗娟1, 3，郭 虹1, 3*，胡利民1, 3*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617 2.兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院，北京 100089 3.方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

研究注射用丹參多酚酸（Salvianolate Lyophilized Injection，SLI）對(duì)氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞株Neuro-2a的保護(hù)作用及機(jī)制。體外培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞，建立OGD/R損傷模型，給予SLI（10、25、50 μg/mL）以及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）干預(yù)，檢測(cè)SLI對(duì)OGD/R損傷Neuro-2a細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出量及細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的釋放；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；采用Western blotting法檢測(cè)凋亡及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。與OGD/R組比較，SLI顯著提高OGD 4 h/R 24 h Neuro-2a細(xì)胞存活率（＜0.05、0.01），降低LDH漏出量（＜0.05、0.01），抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)Cyt-C釋放（＜0.05、0.01），調(diào)節(jié)活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease，cleaved Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）。SLI還可以增加OGD 4 h/R 6 h細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3II，LC3Ⅱ）、自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）表達(dá)（＜0.05、0.01），減少自噬選擇性底物p62蓄積（＜0.05、0.01）。加入自噬抑制劑，可以抵消SLI對(duì)OGD/R損傷Neuro-2a細(xì)胞的保護(hù)及凋亡抑制作用。此外，SLI可以降低磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）水平以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）表達(dá)（＜0.05、0.01），介導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。SLI對(duì)OGD/R損傷后的Neuro-2a細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。

注射用丹參多酚酸；氧糖剝奪/再灌注；Neuro-2a細(xì)胞；自噬；凋亡；蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路

缺血性腦卒中是一種常見(jiàn)的腦血管疾病，不僅嚴(yán)重影響人們的身心健康，而且給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。以往研究表明，缺血性腦卒中以氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和血管通透性增加等各種病理和生理變化為特征[1-2]。近來(lái)研究表明，細(xì)胞自噬和凋亡可同時(shí)參與缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，并且兩者之間存在相互作用[3]。

細(xì)胞自噬是一種分解代謝過(guò)程，是真核細(xì)胞中存在的重要現(xiàn)象。越來(lái)越多的證據(jù)表明，自噬參與了缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展，而且細(xì)胞自噬和凋亡參與相同的通路，由此形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。在大鼠缺血再灌注的早期過(guò)程中，激活自噬可以為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）誘導(dǎo)的損傷提供一定的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。在新生大鼠缺氧模型中，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑雷帕霉素治療后，可以誘導(dǎo)自噬并發(fā)揮對(duì)大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。自噬還可以通過(guò)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-asparate protease，Caspase）依賴性途徑來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，從而減輕細(xì)胞損傷[6]。因此，自噬的激活可能成為治療缺血性卒中的潛在方向。然而，自噬是一把“雙刃劍”。在某些特殊情況下，過(guò)度自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，在缺血性卒中的進(jìn)展中發(fā)揮有害作用[7]。自噬可以與細(xì)胞凋亡同時(shí)發(fā)生，或自噬可能首先占主導(dǎo)地位，但最終會(huì)導(dǎo)致自噬相關(guān)的細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。總之，自噬和細(xì)胞凋亡之間的相互作用和串?dāng)_是復(fù)雜而重要的。因此，缺血性腦卒中后如何干預(yù)自噬的發(fā)展是組織修復(fù)和功能恢復(fù)的關(guān)鍵。

注射用丹參多酚酸（Salvianolate Lyophilized Injection，SLI）是從丹參中提取的水溶性物質(zhì)，臨床主要用于治療輕中度缺血性腦卒中[9-11]。Chen等[12]研究表明SLI中含有的主要成分為多種丹酚酸，主要包括原兒茶醛、丹酚酸B、丹酚酸Y、丹酚酸D、丹酚酸E、精酸和迷迭香酸的非對(duì)映異構(gòu)體，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究證實(shí)，SLI對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用，其可能與減輕氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[13-14]。目前關(guān)于SLI如何調(diào)節(jié)自噬和凋亡以及SLI誘導(dǎo)的自噬和凋亡之間的相互作用的報(bào)道較少。因此，本研究旨在揭示SLI對(duì)氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞株Neuro-2a自噬和凋亡的影響，并進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬和凋亡之間的關(guān)系。

1 材料

1.1 細(xì)胞

Neuro-2a細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。

1.2 藥品與試劑

SLI（批號(hào)20151004，0.13 g/支，含丹參多酚酸100 mg、輔料甘露醇30 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011）由天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供；MEM培養(yǎng)基（批號(hào)SH30024.01）、青霉素、鏈霉素（批號(hào)SV30010）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CK04）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；胎牛血清（批號(hào)10099141C）、胰蛋白酶（批號(hào)25200056）、D-Hank’s（批號(hào)13150016）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)A13199）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA測(cè)定試劑盒（批號(hào)23227）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP底物（批號(hào)WBKLS0500）、PVDF膜（批號(hào)03010040001）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）抗體（批號(hào)ab48394）、p62抗體（ab56416）、B淋巴細(xì)胞瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)ab27795）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）抗體（批號(hào)3738）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號(hào)4060）、Akt抗體（批號(hào)4685）、mTOR抗體（批號(hào)2983）、β-actin抗體（批號(hào)4970）、cleaved Caspsase-3抗體（批號(hào)9664）購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)ZB-2301）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)ZB-2305）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CytoTox-ONETMHomogeneous Membrane Integrity Assay購(gòu)自美國(guó)Promega公司；自噬抑制劑3-MA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 儀器

FORMA3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；TE200型倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Station 3型多功能讀板機(jī)（美國(guó)MolecularDivices公司）；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；PowerPac? Basic電泳儀、Mini-PROTEAN?Tetra Cell Systems電泳槽、Trans-Blot?SD System半干轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Milli-Q Advantage A10，超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 OGD/R模型的建立

OGD/R模型按照本課題組前期方法建立[15]。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Neuro-2a細(xì)胞消化并吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105個(gè)/mL接種于96孔板中。待Neuro-2a細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，棄去培養(yǎng)基后以D-Hank’s溶液洗滌細(xì)胞3次，換成D-Hank’s平衡鹽溶液置于充滿95% N2、5% CO2混合氣體的缺氧小室氧糖剝奪孵育4 h，再灌注時(shí)置換為完全培養(yǎng)基，放置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24 h以建立OGD/R模型。

2.2 分組與給藥

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置對(duì)照組、OGD/R組、OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）組[16-18]及OGD/R＋3-MA＋SLI（50 μg/mL）組和OGD/R＋3-MA組。

2.2.1 對(duì)照組 將完全培養(yǎng)基替換為MEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后置換為完全培養(yǎng)基孵育0、6、12、24 h。

2.2.2 OGD/R組 將完全培養(yǎng)基替換為D-Hank’s平衡鹽溶液，置于充滿95% N2、5% CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h，然后置換為完全培養(yǎng)基孵育0、6、12、24 h。

2.2.3 OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）組 將完全培養(yǎng)基置換為含有不同濃度SLI的D-Hank’s溶液，置于充滿95% N2、5% CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h后，然后分別置換為含有不同濃度SLI的完全培養(yǎng)基孵育0、6、12、24 h。

2.2.4 OGD/R＋3-MA＋SLI（50 μg/mL）組 將完全培養(yǎng)基置換為含有2.5 mmol/L 3-MA的完全培養(yǎng)基提前孵育1 h，1 h時(shí)后置換為含有50 μg/mL SLI、2.5 mmol/L 3-MA的D-Hank’s溶液，置于充滿95% N2、5% CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h，然后置換為含有50 μg/mL SLI的完全培養(yǎng)基孵育24 h。

2.2.5 OGD/R＋3-MA組 將完全培養(yǎng)基置換為含有2.5 mmol/L 3-MA的完全培養(yǎng)基提前孵育1 h，1 h后置換為含有2.5 mmol/L 3-MA的D-Hank’s溶液，置于充滿95% N2、5% CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h，然后置換為完全培養(yǎng)基孵育24 h。

2.3 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出量的影響

2.3.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定 Neuro-2a細(xì)胞懸液以1×106/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻，即可用于實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞加入藥物干預(yù)后，棄去上清液，每孔加入100 μL含有10% CCK-8的MEM培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育30 min后，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

2.3.2 LDH漏出量的測(cè)定 按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，每孔收集細(xì)胞上清液25 μL，轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，加入預(yù)先配制好的CytoTox-ONETMReagent，20 ℃孵育30 min，加入終止液50 μL，搖晃混合30 s，測(cè)定560 nm/590 nm值。

2.4 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡的影響

按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，Neuro-2a細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用冷的PBS洗滌，然后重懸于150 μL含有5 μL Annexin-V-FITC和1 μL PI的混合緩沖液中。37 ℃避光孵育15 min后，通過(guò)流式細(xì)胞儀定量熒光強(qiáng)度。正常活細(xì)胞不會(huì)被染色，凋亡細(xì)胞可被標(biāo)記上Annexin V，壞死和凋亡晚期細(xì)胞可被Annexin V和PI同時(shí)染色。

2.5 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞Cyt-C釋放的影響

各組加入藥物干預(yù)后，收集Neuro-2a細(xì)胞并洗滌2次。使用Cyt-C檢測(cè)試劑盒測(cè)定Cyt-C釋放。

2.6 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Neuro-2a細(xì)胞懸液以1×106/mL接種在6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻，各組細(xì)胞加入藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，用冷的D-Hank’s平衡緩沖鹽溶液清洗3次，每孔加入100 μL含1%蛋白酶抑制劑PMSF的細(xì)胞裂解液，于冰上孵育10 min，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，再加入Loading Buffer煮沸變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入4%脫脂奶粉，室溫封閉1.5 h，分別加入cleaved Caspsase-3（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、LC3II（1∶1000）、Beclin-1（1∶1000）、p62（1∶1000）、p-Akt（1∶2000）、Akt（1∶1000）、mTOR（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜后，用TBST緩沖液洗滌5次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG抗體（1∶10 000），室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌5次，每次5 min。最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。采用Image J軟件分析各目的蛋白的灰度值，用于計(jì)算各目的蛋白的表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）中的Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞形態(tài)、存活率及LDH漏出量的影響

如圖1-A所示，倒置顯微鏡下可以觀察到，對(duì)照組Neuro-2a細(xì)胞呈多邊形，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞密度大，胞體飽滿；OGD/R組細(xì)胞稀疏，貼壁性差，胞體明顯皺縮；OGD/R＋SLI（10 μg/mL）組細(xì)胞形態(tài)有所改善，輪廓相對(duì)融合；OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）組細(xì)胞形態(tài)較OGD/R組有明顯改善，輪廓融合，細(xì)胞貼壁性良好。如圖1-B、C所示，與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞存活率明顯降低（＜0.01），細(xì)胞上清液中LDH漏出量明顯升高（＜0.01）；與OGD/R組比較，OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01），OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）組細(xì)胞上清液中LDH漏出量均顯著降低（＜0.05、0.01）。表明SLI可以改善OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞損傷，且呈劑量相關(guān)性。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與OGD/R組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡率、Cyt-C釋放量以及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01、0.001），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與OGD/R組比較，OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）組細(xì)胞凋亡率、Cyt-C釋放量以及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。表明SLI在神經(jīng)元OGD/R過(guò)程中具有保護(hù)作用，可減輕OGD/R損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明SLI具有抗細(xì)胞凋亡的特性。

A-Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 B-各組細(xì)胞凋亡率 C-各組細(xì)胞Cyt-C釋放量 D-各組細(xì)胞cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)

3.3 SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3-A所示，與對(duì)照組相比，缺氧4 h后細(xì)胞LC3II蛋白表達(dá)已經(jīng)出現(xiàn)顯著降低（＜0.05），復(fù)氧后6 h達(dá)到最低點(diǎn)（＜0.01）。因此，進(jìn)一步評(píng)估了SLI對(duì)OGD 4 h/R 6 h自噬蛋白表達(dá)的影響。如圖3-B所示，與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞LC3II和Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），p62蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）組LC3II蛋白表達(dá)水平均可顯著升高（＜0.05、0.01），p62蛋白表達(dá)水平均可顯著降低（＜0.05、0.01）；OGD/R＋SLI（50 μg/mL）組Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。表明SLI能夠通過(guò)提高自噬水平發(fā)揮對(duì)OGD/R損傷Neuro-2a細(xì)胞的保護(hù)作用。

3.4 SLI通過(guò)激活自噬抑制OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡

如圖4所示，與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01），LDH漏出量、細(xì)胞凋亡率以及Cyt-C釋放量均明顯升高（＜0.01）；與OGD/R組比較，OGD/R＋SLI（50 μg/mL）組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01），LDH漏出量、細(xì)胞凋亡率和Cyt-C釋放量均顯著降低（＜0.01）。但加入自噬抑制劑3-MA后，與模型組相比，細(xì)胞存活率、LDH漏出量、細(xì)胞凋亡率和Cyt-C釋放量沒(méi)有明顯變化，但與OGD/R＋SLI（50 μg/mL）組比較有顯著性差異（＜0.01）。說(shuō)明加入自噬抑制劑3-MA后，藥物未能對(duì)凋亡細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，從而表明自噬的激活可能在SLI介導(dǎo)的凋亡抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

A-缺氧4 h后，復(fù)氧0、6、12、24 h細(xì)胞LC3II蛋白表達(dá)情況 B-缺氧4 h后，復(fù)氧6 h各組細(xì)胞LC3II、Beclin和p62蛋白表達(dá)情況

A-各組細(xì)胞存活率 B-各組細(xì)胞LDH漏出量 C-Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 D-各組細(xì)胞凋亡率 E-各組細(xì)胞Cyt-C釋放量 與SLI 50 μg·mL?1組比較：&&P＜0.01

3.5 SLI通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路抑制OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡

隨后又檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化水平及mTOR的表達(dá)。如圖5所示，與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞Akt磷酸化水平及mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組比較，OGD/R＋SLI（10、25、50 μg/mL）組Akt磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01），OGD/R＋SLI（25、50 μg/mL）組mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。提示SLI可能通過(guò)抑制Akt/mTOR活性提高自噬水平，從而發(fā)揮對(duì)OGD/R損傷Neuro-2a細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖5 SLI通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路抑制OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡(, n = 3)

4 討論

缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重的腦血管疾病，是指腦血管狹窄或閉塞，最終導(dǎo)致腦組織缺氧甚至壞死[19]。中醫(yī)認(rèn)為缺血性中風(fēng)屬于血瘀證范疇，“活血化瘀”是最常用的治療方法，而丹參是“活血化瘀”最常用的藥物之一，且丹參類(lèi)制劑對(duì)心腦血管系統(tǒng)有較好作用[20]。SLI是利用冷凍干燥法從丹參水溶性提取物中分離得到，在我國(guó)臨床上已廣泛用于治療急性缺血性腦卒中。本課題組前期研究顯示，SLI可以促進(jìn)腦缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion/ reperfusion，MCAO/R）損傷或糖尿病模型中風(fēng)后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與減少氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)血腦屏障功能有關(guān)[21-23]。然而，其潛在的作用機(jī)制尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究。因此，本研究在Neuro-2a細(xì)胞中建立OGD/R模型探索了SLI的保護(hù)機(jī)制，并且證明了SLI對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其可以通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR依賴的自噬途徑減少神經(jīng)元凋亡。

細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制，并且在腦I/R損傷期間顯著加重[24]。在凋亡過(guò)程中，Cyt-C從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)中，隨后招募并導(dǎo)致Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。最終，Caspase-3被活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。Bcl-2家族主要參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[26]，是一種主要的抗凋亡蛋白。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLI明顯降低了OGD/R誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞的凋亡率，抑制了Cyt-C的釋放，降低了cleaved Caspase-3的表達(dá)，并上調(diào)了Bcl-2蛋白表達(dá)水平，證明SLI在體外具有抗凋亡作用。

越來(lái)越多的證據(jù)支持自噬的調(diào)節(jié)是腦I/R損傷的一種機(jī)制。Luo等[27]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt途徑抑制自噬有助于防止缺血損傷引起的神經(jīng)元死亡。相反，Yu等[28]提出適度激活自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR增加海馬神經(jīng)元的自噬，減少再灌注損傷，保護(hù)神經(jīng)元。關(guān)于自噬在缺血性卒中中的作用存在相互矛盾的報(bào)道，這可能與損傷程度和時(shí)間有關(guān)。因此，自噬在缺血性腦卒中是有益還是有害仍有待進(jìn)一步討論。本研究發(fā)現(xiàn)自噬水平隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后升高，并在復(fù)氧24 h后恢復(fù)到正常水平。也就是說(shuō)，自噬在腦缺血早期被激活，這與之前的報(bào)道一致[29]。本研究發(fā)現(xiàn)SLI可以激活OGD/R誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬，增加LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，減少p62的積累，并最終提高細(xì)胞存活率。總之，SLI在體外表現(xiàn)出明顯的自噬保護(hù)作用。

許多應(yīng)激途徑依次引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的自噬和凋亡，它們之間的相互作用復(fù)雜但意義重大。Luo等[30]證實(shí)自噬可能通過(guò)減少凋亡相關(guān)分子表達(dá)而表現(xiàn)為抗凋亡機(jī)制。然而，He等[31]研究表明，凋亡激活通常與自噬增加有關(guān)。在許多情況下，自噬先于凋亡。Sirois等[32]觀察到自噬早于細(xì)胞凋亡的發(fā)展，并在細(xì)胞凋亡被激活時(shí)持續(xù)發(fā)生。在本研究中，自噬抑制在復(fù)氧6 h時(shí)處于最低點(diǎn)，然后逐漸升高，復(fù)氧24 h細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。這表明自噬先于凋亡發(fā)生，與文獻(xiàn)中的報(bào)道一致。本研究的局限性在于沒(méi)有對(duì)凋亡進(jìn)行時(shí)間相關(guān)性分析，并且對(duì)自噬檢測(cè)僅持續(xù)到復(fù)氧24 h，自噬是否會(huì)繼續(xù)上升并導(dǎo)致過(guò)度自噬尚不清楚。但SLI能夠明顯逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的自噬抑制和凋亡的發(fā)生，而且SLI激活自噬的時(shí)間早于抑制凋亡的時(shí)間。此外，當(dāng)自噬抑制劑3-MA抑制自噬時(shí)，SLI提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞凋亡和Cyt-C釋放的能力減弱，表明SLI可以通過(guò)上調(diào)自噬抑制細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是經(jīng)典的自噬通路。mTOR是自噬的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，位于PI3K/Akt通路的下游。研究顯示，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)皮層神經(jīng)元中的PI3K/Akt/mTOR通路由自噬介導(dǎo)的[33]。同時(shí)，PI3K/Akt/mTOR通路是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制細(xì)胞凋亡[34]?；谠撏緩剑w外觀察了OGD/R處理后，給予SLI的Neuro-2a細(xì)胞中p-Akt和mTOR的表達(dá)。結(jié)果表明，SLI可以下調(diào)p-Akt和mTOR的表達(dá)，從而促進(jìn)自噬。這表明SLI對(duì)缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)作用可以通過(guò)Akt/mTOR通路調(diào)節(jié)自噬活性。但是，Akt/mTOR信號(hào)通路并不是調(diào)節(jié)自噬的唯一通路，為了進(jìn)一步闡明SLI是否可以調(diào)節(jié)Akt通路，可以使用Akt磷酸化抑制劑Ly294002在后續(xù)研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究主要探索了OGD/R誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞后自噬與凋亡的關(guān)系，并研究了Akt/mTOR信號(hào)通路在調(diào)控Neuro-2a細(xì)胞中的作用。發(fā)現(xiàn)SLI通過(guò)誘導(dǎo)自噬和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)改善OGD/R誘導(dǎo)的損傷，并通過(guò)Akt/mTOR依賴性途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Salvianolate Lyophilized Injection induced autophagy against neuronal apoptosis through Akt/mTOR pathway in Neuro-2a cells

ZHANG Wen-qi1, LI Dong-na1, MA Meng-meng2, XU Yang-yang1, WANG Shao-xia1, CHAI Li-juan1, 3, GUO Hong1, 3, HU Li-min1, 3

1.State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2.Beijing Northern Hospital of Weaponry Industry, Beijing 100089, China 3.Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae, Ministry of Education, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the protective effect and mechanism of Salvianolate Lyophilized Injection (注射用丹參多酚酸, SLI) on oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R)-injured mouse brain neuroma cell line Neuro-2a.Neuro-2a cells were cultured, OGD/R injury model was established, SLI (10, 25, 50 μg/mL) and autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) ??were administered for intervention.Effects of SLI on survival rate, lactate dehydrogenase (LDH) leakage and cytochrome C (Cyt-C) release of OGD/R-injured Neuro-2a cells were detected; Apoptosis was detected by flow cytometry; Expressions of apoptosis and autophagy-related proteins were detected by Western blotting.Compared with OGD/R group, SLI significantly increased the survival rate of Neuro-2a cells induced by OGD 4 h/R 24 h (< 0.05, 0.01), decreased the leakage of LDH (< 0.05, 0.01), inhibited cell apoptosis and Cyt-C release (< 0.05, 0.01), regulated cleaved cystein-asparate protease (cleaved Caspase-3) and B lymphoma-2 (Bcl-2) protein expressions (< 0.05, 0.01).SLI increased the expressions of autophagy-associated protein microtubule-associated protein 1 light chain 3II (LC3II) and autophagy effector protein (Beclin-1) in cells induced by OGD 4 h/R 6 h (< 0.05, 0.01), reduced the accumulation of autophagy-selective substrate p62 (< 0.05, 0.01).The addition of an autophagy inhibitor could counteract the protective and apoptosis inhibitory effects of SLI on OGD/R-injured Neuro-2a cells.In addition, SLI could reduce the level of phosphorylated protein kinase B (p-Akt) and expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) (< 0.05, 0.01) to mediate autophagy.SLI has a protective effect on Neuro-2a cells after OGD/R injury, its mechanism may be regulating the autophagy mediated by Akt/mTOR signaling pathway, thereby inhibiting apoptosis.

Salvianolate Lyophilized Injection; oxygen-glucose deprivation/reperfusion; Neuro-2a cells; apoptosis; autophagy; protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2706 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.013

2022-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573644）；國(guó)家重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012ZX09101202）

張?chǎng)╃鳎?996—），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)相關(guān)研究。E-mail: 17622738901@163.com

通信作者：郭 虹（1983—），博士生導(dǎo)師，主要從事中藥腦血管及神經(jīng)藥理研究。E-mail: cacti1983@163.com

胡利民（1966—），博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管藥理研究。E-mail: huliminth@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]