張立強(qiáng)，雷 靜

寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750011

0 引言

牛病毒性腹瀉病（Bovine Viral Diarrhea，BVD）是由牛感染牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引起以發(fā)熱、腹瀉、消化道黏膜糜爛、產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)和死胎等為特征的一類急性、接觸性傳染病[1]。BVDV感染奶牛后會(huì)造成奶牛發(fā)生持續(xù)性感染、免疫抑制，會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期帶毒乃至終生帶毒的狀態(tài)，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了巨大影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。1946年，Olafson等[3]首先發(fā)現(xiàn)BVDV在美國(guó)紐約州存在；1980年，該病毒在我國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)[4]。目前該病毒已經(jīng)在我國(guó)各個(gè)省市和地區(qū)廣泛流行，成為我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的潛在危險(xiǎn)，影響奶牛業(yè)的健康發(fā)展。

BVDV是一種具有囊膜的正鏈RNA病毒，屬黃病毒科、瘟病毒屬成員[5]。基因組長(zhǎng)12～13 kb，由三部分組成，分別是5'端非編碼區(qū)、開(kāi)放閱讀框（ORF）編碼區(qū)和3'端非編碼區(qū)[6]。BVDV的主要來(lái)源是帶毒動(dòng)物及被感染的患病動(dòng)物。冬末和春季是本病的高發(fā)季節(jié)。BVDV遍布于世界各國(guó)，呈地方流行性，在封閉集約化的牧場(chǎng)發(fā)病常呈爆發(fā)式流行[7]。由于BVDV感染牛對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成的損害十分嚴(yán)重，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為B類疫病，也是在我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物必需進(jìn)行檢疫的疾病之一[8]。為了揭示寧夏銀川地區(qū)某規(guī)模牧場(chǎng)犢牛BVDV的感染情況，采集該牧場(chǎng)犢牛血液共計(jì)69份，糞便拭子69 份，通過(guò)血清流行病學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查的方法檢測(cè)BVDV，為該地區(qū)防控BVDV提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年9月至2021年12月采集銀川地區(qū)某規(guī)模牧場(chǎng)犢牛血液69 份，放置于采血器中析出血清，分裝至1.5 mL離心管中并進(jìn)行編號(hào)，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫患S便拭子樣品69 份，-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

BVDV ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，IDEXX公司；PrimeScript? RT Master Mix，病毒RNA提取試劑盒，2×PCR MIX，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 樣品處理

將采集血液的采血器放于室溫靜置等待血清析出，將析出血清移至干凈的1.5 mL離心管中，編號(hào)，放置于-20 ℃冰箱保存。

在-80 ℃低溫冰箱中將糞便拭子樣品取出，放置于4 ℃冰箱中融化，加入2 mL超純水，充分振蕩搖勻，混勻，取1.2 mL混勻液體于1.5 mL離心管，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，離心后取上清液，用0.22 μm微孔濾膜，得到樣品，放置于-80 ℃低溫冰箱中保存，備用。

1.4 血清學(xué)抗原檢測(cè)

ELISA檢測(cè)：取出犢牛血清，恢復(fù)至室溫后，按照IDEXX BVDV抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果判定如下：檢測(cè)計(jì)算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.300，可判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，則可判為BVDV抗原陽(yáng)性。

1.5 BVDV RT-PCR 檢測(cè)

1．5．1 RNA提取

從-80 ℃低溫冰箱中將處理的糞便樣品，放置在4 ℃冰箱中進(jìn)行融化，使用病毒RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書提取RNA，按照PrimeScript? RT Master Mix將提取樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1．5．2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)王標(biāo)[6]采用的方法，設(shè)計(jì)通用檢測(cè)引物（表1）。

表1 BVDV 5'-UTR 基因的引物序列

1．5．3 RT-PCR檢測(cè)

按照表2反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件進(jìn)行RT-PCR，結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠試驗(yàn)，分析條帶大小，判定結(jié)果。

表2 RT-PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

1.6 微流控芯片檢測(cè)BVDV

1．6．1 樣品準(zhǔn)備

按照愛(ài)基因公司犢牛腹瀉相關(guān)病原四聯(lián)快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，提取血清中的RNA，-80 ℃保存待檢。

1．6．2 試劑準(zhǔn)備

將試劑盒各試劑充分混勻，分裝入1.5 mL離心管后加入熒光等溫?cái)U(kuò)增預(yù)混液20 μL，備用。

1．6．3 反應(yīng)條件

溫度：63.5℃，時(shí)間：30 min，程序：低速離心1 600r/min 10 s：高速離心轉(zhuǎn)速4 600 r/min 30 s

1．6．4 判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性：反應(yīng)結(jié)束后，項(xiàng)目檢測(cè)孔位出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，且Ct值＜30，判定該孔樣品為陽(yáng)性。

陰性：反應(yīng)結(jié)束后，項(xiàng)目檢測(cè)孔位未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線，判定該孔樣品為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA 和RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

本次試驗(yàn)對(duì)寧夏銀川地區(qū)某規(guī)模牧場(chǎng)69 份疑似BVDV感染的犢牛血液進(jìn)行了BVDV抗原ELISA檢測(cè)；對(duì)69 份疑似BVDV感染的犢牛糞便樣品進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率均為為7.24%（5/69），結(jié)果見(jiàn)表3，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表3 BVDV 感染的ELISA 和RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖1 病原核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2 微流控芯片檢測(cè)結(jié)果

愛(ài)基因微流控芯片犢牛腹瀉相關(guān)病原檢測(cè)試劑盒結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照見(jiàn)圖2；陰性對(duì)照見(jiàn)圖3；5 份陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，5 份樣品均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，確定為BVDV陽(yáng)性。

圖2 微流控芯片犢牛腹瀉相關(guān)病原檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照

圖3 微流控芯片犢牛腹瀉相關(guān)病原檢測(cè)陰性對(duì)照

圖4 微流控芯片犢牛腹瀉相關(guān)病原樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)銀川地區(qū)某規(guī)模牧場(chǎng)犢牛BVDV的感染狀況應(yīng)用ELISA與RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，BVDV陽(yáng)性牛檢出率為7.24%。因BVDV對(duì)奶牛場(chǎng)危害非常嚴(yán)重，并且此病無(wú)特效藥，現(xiàn)在規(guī)模化奶牛場(chǎng)均制定免疫程序?qū)θＨ哼M(jìn)行免疫接種，防控措施主要以免疫-檢疫-淘汰為主[10]。