徐潔娜, 夏明慧, 樊婷婷

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

隨著地球水資源的不斷減少,土壤鹽漬化程度越來越嚴重,高鹽環(huán)境對植物的生長有著極其嚴重的影響,從而影響全球農(nóng)作物產(chǎn)量[1-2],因此找到響應(yīng)鹽脅迫關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,以及參與到信號通路的下游基因十分重要[3-4]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)優(yōu)化植物品種以達到抗鹽目的是目前解決以上問題較為經(jīng)濟快捷的方式[5]。

細胞質(zhì)中過量游離性的Na+對植物細胞有害,因此植物應(yīng)該嚴格限制Na+的吸收、長距離運輸和積累[6]。已知編碼高親和力K+轉(zhuǎn)運體的基因HKT1,介導(dǎo)Na+從木質(zhì)部到木質(zhì)部薄壁細胞的運輸,減少了木質(zhì)部Na+含量,大大提高了植物的耐鹽性[7]。目前,關(guān)于HKT1耐鹽的機理已明確,但是其上游調(diào)控機制尚不明確?，F(xiàn)已知MYBX是一個響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其功能缺失突變體對150 mmol/L NaCl高度敏感。初步分析發(fā)現(xiàn)基因HKT1在突變體mybx中表達量明顯降低,在過表達植株中顯著上升。因此,本文推測MYBX基因正向調(diào)控HKT1基因的表達,需要探索其基因上下游的關(guān)系,構(gòu)建HKT1的過表達載體,獲得1300-HKT1表達菌株,成功侵染mybx突變體,得到1300-HKT1/mybx轉(zhuǎn)基因材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、野生型Col-0和突變體mybx,購于美國擬南芥種質(zhì)資源中心。

1.1.2 宿主和載體

大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、pCAMBIA1300質(zhì)粒。

1.1.3 分子生物學(xué)試劑

Trizol(RNA提取試劑)、PrimeSTAR酶(高保真DNA聚合酶)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit 50-preps、OMEGA瓊脂糖膠回收試劑盒Cycle-Pure Kit(購于北京安諾倫生物科技有限公司);DNA supermix(DNA聚合酶,生工牌)、限制性核酸內(nèi)切酶(NEB牌)、T4連接酶(購于TaKaRa公司);合成引物(Oligo軟件設(shè)計)由生工生物工程(上海)股份有限公司;其余試劑為分析純。

1.2 擬南芥無菌苗的培養(yǎng)

從4 ℃冰箱取出MS(Murashige & Skoog)培養(yǎng)基,恢復(fù)至室溫,以100 mL的培養(yǎng)基為例。稱取0.435 g MS培養(yǎng)基,蔗糖0.8 g,瓊脂粉1.2 g。加入ddH2O混勻后,調(diào)pH值至5.8,高溫滅菌,倒入平板等其凝固。在無菌操作臺內(nèi)使用1 mL 0.1%的HgCl2溶液重懸擬南芥種子,時間控制在3 min內(nèi),然后用無菌的ddH2O重懸種子3次,棄上清,將無菌的擬南芥種子轉(zhuǎn)移至無菌濾紙上,待其干燥后,按照實驗需求播種在培養(yǎng)基上。播種結(jié)束后,用封口膜將培養(yǎng)皿密封保存于4 ℃冰箱,春化3 d后放置于光照培養(yǎng)間豎直培養(yǎng)14 d。

1.3 植物RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

提前洗凈研缽放置60 ℃烘箱烘干后,用錫箔紙包裹置于180 ℃烘箱3～6 h,再轉(zhuǎn)移至冰柜預(yù)冷待用。所用試劑氯仿、異丙醇、無水乙醇也同時放置冰箱預(yù)冷。收集培養(yǎng)皿中的無菌苗,置于預(yù)冷的研缽中,加入液氮研磨至粉末發(fā)白,加入1 mL Trizol,繼續(xù)研磨,直至混合物變成清亮的液體,轉(zhuǎn)移至預(yù)先標記好的1.5 mL離心管中,冰上靜置5 min,接著13 000 r/min、4 ℃離心10 min;吸取上清至新的離心管中,加入200 μL預(yù)冷的氯仿,劇烈震蕩15 s,靜置5 min,接著13 000 r/min、4 ℃離心5 min;吸取上清至新的離心管中,沿壁緩緩加入500 μL預(yù)冷的異丙醇,輕柔上下顛倒數(shù)次,冰上靜置15 min,13 000 r/min、4 ℃離心15 min;小心棄掉上清,再一次沿壁緩緩加入1 mL 75%的乙醇,8 000 r/min、4 ℃離心5 min,棄上清,沉淀即為所提RNA。室溫晾干,加入50 μL DEPC水,65 ℃水浴10 min,期間輕柔吹打液體使其充分溶解。取2 μL RNA,測得RNA質(zhì)量濃度和純度后,根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整RNA的加樣量,盡量保證其質(zhì)量濃度一致。依據(jù)Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成cDNA。

1.4 載體構(gòu)建

在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)內(nèi)找到擬南芥HKT1基因序列(TAIR:AT4G10310),利用Oligo引物合成軟件來設(shè)計HKT1編碼區(qū)的上下游引物。根據(jù)pCAMBIA1300載體酶切位點信息以及基因本身序列信息,選擇XhoⅠ和HindⅢ這2個限制性酶切二位點。將這2個酶切位點堿基序列分別加在上下游引物的5’端。上游引物為:

5’-CCGCTCGAGATGGACAGAGTGGTGGCAAAA-3’,

下游引物為:

5’-CCCAAGCTTTTAGGAAGACGAGGGGTAAAG-3’。

以擬南芥野生型(WT)的cDNA為擴增模板,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR),獲得HKT1基因片段,凝膠回收PCR產(chǎn)物,取38 μL片段或質(zhì)粒,加入相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶1 μL(動作迅速且在冰上操作)和5 μL CutSmart,最后用ddH2O補齊至50 μL體系,吹打混勻后,放置于37 ℃金屬浴中孵育,目的基因片段酶切2 h,質(zhì)粒酶切4 h。凝膠回收后,酶切片段和酶切載體相連以轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞,并鑒定陽性克隆(命名為1300-HKT1)用于測序。測序成功后的大腸菌株進一步擴培,利用質(zhì)粒抽提試劑盒獲取目的質(zhì)粒,載體構(gòu)建成功。

1.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

提前準備預(yù)冷的電擊杯,取出-80 ℃凍存的GV3101,加入1 μL重組質(zhì)粒,輕混勻后轉(zhuǎn)移至電擊杯中,設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù),電脈沖25 μF,電壓1 800 V,啟動電脈沖。經(jīng)過電擊后,迅速取出電擊杯,向其中加入500 μL預(yù)冷的液體培養(yǎng)基,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。待LB渾濁后,在無菌操作臺內(nèi)將菌液轉(zhuǎn)移至含有100 mg/mL卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基上,吹干,30 ℃培養(yǎng)箱密封培養(yǎng)2 d。待農(nóng)桿菌菌落直徑約為2 mm時,即可挑取單克隆至500 μL相應(yīng)抗性液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng),24 h后PCR鑒定,通過凝膠電泳結(jié)果選取活性較高的菌落保菌,存于-80 ℃待用。

1.6 浸花法侵染擬南芥

土培繁殖mybx突變體,待其生長至6周左右,頂端分生組織發(fā)育旺盛、花苞較多,正是侵染構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料的最佳時期。提前配制MS/蔗糖侵染緩沖液。活化1300-HKT1農(nóng)桿菌:從-80 ℃冰箱中取出甘油菌,吸取100 μL菌液于5 mL含有50 mg/mL慶大霉素和100 mg/mL卡那霉素的雙抗性液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min過夜活化;在無菌操作臺內(nèi)吸取2 mL過夜活化的菌液于100 mL 同樣的雙抗性液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌液至OD600=1.0～1.5。5 000 r/min、5 min離心收集菌體,侵染緩沖液重懸沉淀菌體3次,最后稀釋管底菌體至OD600=0.5～1.0,取10 mL菌液加入0.1 μL的Silwet-77,將其混勻后靜置避光待用。

處理待侵染植株方法如下:剪去突變體材料已授粉的花及果莢,將剩下未授粉的花苞浸入侵染液中15 s,保證植株每個未授粉的花苞都被侵染液潤濕;整盆擬南芥侵染完用保鮮膜將整棵植株包裹,保持其濕潤度,黑暗處理過夜;2 d后,小心去除保鮮膜恢復(fù)光照;1周后再次侵染。2周左右果莢陸續(xù)成熟,此時可收集種子并放入37 ℃的培養(yǎng)箱進行干燥處理,隨后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱春化,篩選待用。

1.7 轉(zhuǎn)基因材料篩選

提前配制含有20 mg/mL潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基,方法與本文擬南芥無菌苗培養(yǎng)方法中固體培養(yǎng)基配制方法一致。在無菌操作臺內(nèi)將消過毒的種子均勻地灑在培養(yǎng)基上,封口密封保存于冰箱4 ℃春化3 d。由于潮霉素見光易分解,轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)間初期需要黑暗處理3 d,然后正常光照培養(yǎng)12 d。挑選子葉大而綠根且長的無菌苗,移至土培,保鮮膜包裹整個花盆以營造一個穩(wěn)定的微環(huán)境供轉(zhuǎn)基因苗生長,直至無菌苗長出新的子葉,方可揭掉保鮮膜。14 d后提取葉子的DNA進行PCR分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的PCR擴增

利用生長2周的無菌苗所提RNA反轉(zhuǎn)出的cDNA為模板,通過PCR擴增出目的基因HKT1的CDS序列,該序列長度為1 521 bp,凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知,條帶大小與基因片段長度相吻合。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收HKT1基因片段用于后續(xù)實驗。

圖1 擬南芥HKT1基因片段的克隆

2.2 目的基因與pCAMBIA1300質(zhì)粒的雙酶切

各取38 μL回收純化的HKT1基因片段和空載質(zhì)粒pCAMBIA1300分別加入限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ進行雙酶切,酶切后電泳結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出,酶切效果良好,無拖帶彌散雜帶情況,目的條帶清晰,且大小符合基因長度。接著使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物,利用T4-DNA Ligase 將酶切后的基因片段和pCAMBIA1300質(zhì)粒在16 ℃的金屬浴中連接14 h,獲得連接產(chǎn)物。

圖2 基因和質(zhì)粒雙酶切

2.3 大腸桿菌重組質(zhì)粒陽性菌落的PCR鑒定

將連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中,涂布于卡那霉素的單抗性LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后挑取單菌落,液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后通過PCR鑒定出陽性菌落。大腸桿菌重組質(zhì)粒陽性菌落PCR鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。從圖4可以看出，條帶大小與目的基因大小基本一致。經(jīng)過測序比對,成功得到含有目的基因的重組質(zhì)粒載體。

圖3 大腸桿菌菌落PCR驗證

2.4 農(nóng)桿菌陽性菌落的PCR鑒定

用質(zhì)粒小提試劑盒提取測序正確的大腸桿菌重組質(zhì)粒,將正確質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中,涂布于相應(yīng)抗性的的LB固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)2 d后,挑取單克隆于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR鑒定,由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出,條帶大小與目的片段大小基本一致,說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,可進行下一步突變體植株的侵染實驗。

圖4 農(nóng)桿菌菌落PCR驗證

2.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株的抗性篩選

通過浸花侵染法侵染mybx突變體收到的種子,播種在含有20 mg/mL潮霉素的LB抗性固體培養(yǎng)基上。2周后,陽性植株會正常生長,未侵染成功的植株因不攜帶潮霉素抗性基因而無法在含有潮霉素抗性的培養(yǎng)基上生長,表現(xiàn)出黃化甚至不發(fā)芽的狀態(tài),如圖5所示。隨后將陽性苗轉(zhuǎn)移至土壤中培養(yǎng)。

圖5 轉(zhuǎn)基因陽性植株抗性篩選

2.6 轉(zhuǎn)基因陽性植株的分子鑒定

為了進一步確定篩選出的擬南芥幼苗是實驗所需的1300-HKT1/mybx轉(zhuǎn)基因材料,并提取其蓮座葉的DNA進行分子鑒定,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，凝膠電泳圖中條帶大小與基因片段大小一致,證明1300-HKT1/mybx轉(zhuǎn)基因材料構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

圖6 轉(zhuǎn)基因陽性植株分子鑒定凝膠電泳圖

3 討 論

迄今為止,全球范圍內(nèi)鹽堿化土地約有950×104hm2,我國的鹽堿化土地面積約[8]為270×104hm2。當土壤中的可溶性鹽超標,就會影響土壤上植物的生長。鹽脅迫包括滲透脅迫和離子脅迫以及由此引起的次級脅迫(如氧化脅迫)等一系列復(fù)雜的相應(yīng)機制可能會造成植物生長滯緩,甚至死亡[9]。而我國經(jīng)濟型農(nóng)作物多為鹽脅迫敏感性植物,因此,合理開發(fā)和利用鹽漬化土壤資源的根本途徑,便是利用基因工程技術(shù)培育耐鹽性作物品種[8]。而植物的鹽脅迫響應(yīng)屬于多基因控制的復(fù)雜性狀,因此構(gòu)建相應(yīng)的鹽脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有利于找出各信號途徑內(nèi)部的基因表達調(diào)控關(guān)系,找到鹽脅迫環(huán)境下的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑有助于揭示植物的耐鹽脅迫機理[10]。因為轉(zhuǎn)錄因子MYBX響應(yīng)鹽脅迫信號,并且正向調(diào)控HKT1基因的表達,從而使得植物對高鹽環(huán)境耐受,所以MYBX-HKT1信號通路機制,為植物抗鹽方向提供了新思路。