蘇治國(guó) 范金財(cái) 劉立強(qiáng) 焦虎

成纖維細(xì)胞為皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，是各種瘢痕組織中的主要細(xì)胞成分。成纖維細(xì)胞的功能狀態(tài)是影響病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素[1]。因此，體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞可在細(xì)胞水平對(duì)各種病理性瘢痕的形成機(jī)制進(jìn)行研究，為尋找切實(shí)有效的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。正常皮膚與瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的提取方法基本相同，按照是否需要消化酶，可分為酶消化法與組織塊貼壁法。組織塊貼壁法培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，而酶消化法操作步驟較多，過(guò)程復(fù)雜。因此，尋找一種更高效、更簡(jiǎn)便易行的成纖維細(xì)胞提取方法有其必要性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原酶消化剩余的組織碎屑內(nèi)可以較快地長(zhǎng)出成纖維細(xì)胞。受這一現(xiàn)象啟發(fā)，我們對(duì)成纖維細(xì)胞提取的傳統(tǒng)酶消化法進(jìn)行了改良，探索應(yīng)用免過(guò)濾酶消化法進(jìn)行成纖維細(xì)胞提取，并取得了較好的效果。本實(shí)驗(yàn)分別采用傳統(tǒng)酶消化法、組織塊貼壁法與免過(guò)濾酶消化法進(jìn)行組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的提取，評(píng)價(jià)免過(guò)濾酶消化法提取細(xì)胞的效果及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的瘢痕疙瘩標(biāo)本（n=8）均來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院?；颊唏：鄹泶窬挥谛夭浚R床診斷明確，年齡19～36 歲。本組患者的瘢痕疙瘩形成時(shí)長(zhǎng)為2～5 年，均未接受過(guò)放射或病灶內(nèi)注射治療。本研究由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018－08），患者均已簽署知情同意書(shū)。

0.2 %Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國(guó)）；10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyelone，美國(guó)）；2%胰蛋白酶（Thermo Fisher，美國(guó)）；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Dojindo，日本）；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒（南京建成科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞的提取及分組原代培養(yǎng)

將瘢痕疙瘩組織平均分為3 組，分別采用免過(guò)濾酶消化法、傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法進(jìn)行組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的提取。按不同的細(xì)胞提取方法為分組依據(jù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

免過(guò)濾酶消化法：將瘢痕疙瘩組織用眼科剪剪成不大于1 mm3的組織碎塊。將碎組織塊移入50 mL離心管中，加入20 mL 的0.2%Ⅰ型膠原酶，搖勻，置于37 ℃搖床消化4 h。消化后，1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清液。加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL。將細(xì)胞與組織碎屑吹打均勻，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 更換一次培養(yǎng)液。

傳統(tǒng)酶消化法：前面方法同上，在37 ℃搖床消化4 h 后，用100 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾。取濾過(guò)液1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清液。加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL，將細(xì)胞與組織碎屑吹打均勻，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d更換一次培養(yǎng)液。

組織塊貼壁法：將瘢痕疙瘩組織用眼科剪剪成1 mm3左右的組織碎塊，移至75 cm2培養(yǎng)瓶中，并將其均勻接種于培養(yǎng)瓶底，組織塊間距0.3～0.5 mm。輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。6 h后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)孵育。7 d 后第一次換液，以后每3～4 d 更換一次培養(yǎng)液。

倒置相差顯微鏡下觀察各組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并記錄細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部80%的所需時(shí)間。用2%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取第1 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 成纖維細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

每組取5×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，重復(fù)3個(gè)孔。24 h 后，吸除各孔中原培養(yǎng)液。每孔加入100 μL 含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，利用CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各孔細(xì)胞的增殖活性。向每孔中加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃培養(yǎng)1.5 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm 的光密度值，即為所測(cè)孔內(nèi)細(xì)胞的增殖活性（相對(duì)值）。檢測(cè)完成后，將各孔中培養(yǎng)液吸除，PBS 清洗2 遍。每孔加入100 μL 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，再次檢測(cè)各孔細(xì)胞的增殖活性。計(jì)算各孔24 h 后第二次檢測(cè)的細(xì)胞活性相對(duì)于第一次檢測(cè)的細(xì)胞活性的增長(zhǎng)率。

1.2.3 成纖維細(xì)胞膠原分泌功能檢測(cè)

每組取5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，重復(fù)3個(gè)孔；24 h 后，吸除各孔中原培養(yǎng)液。每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清液進(jìn)行羥脯氨酸含量檢測(cè)。取無(wú)細(xì)胞孔的培養(yǎng)液作為空白組，排除外源性羥脯氨酸影響。采用羥脯氨酸測(cè)定試劑盒（堿水解法）進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)將上清液l mL 加入有蓋試管中，加水解液1 mL，沸水浴水解20 min，調(diào)整pH 值至6.0～6.8。加雙蒸水至10 mL，混勻，取3～4 mL 水解液加20～30 mg 活性炭，混勻，3 500 r/min 離心10 min，取上清1 mL進(jìn)行檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入檢測(cè)試劑，混勻。60 ℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min 離心10 min。取上清液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在550 nm 的光密度值。根據(jù)各孔光密度值計(jì)算其羥脯氨酸含量，并進(jìn)行對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)情況

免過(guò)濾酶消化法提取細(xì)胞，在接種后2～3 d 即可觀察到瓶底沉降的組織碎屑周邊有細(xì)小的芽狀貼壁細(xì)胞游出，逐漸伸展長(zhǎng)大，向四周呈放射狀生長(zhǎng)；單獨(dú)貼壁的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好（圖1）；成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%所需時(shí)間為7～13 d，平均（9.50±2.07）d。傳統(tǒng)酶消化法接種后，成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%所需時(shí)間為10～14 d，平均（12.75±1.91）d。組織塊貼壁法在將組織塊接種后6～10 d 可觀察到組織塊周圍有芽狀細(xì)胞爬出（圖2）；細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%所需時(shí)間為15～22 d，平均（19.00±2.27）d。免過(guò)濾酶消化法提取的細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%所需時(shí)間明顯短于傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法（圖3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3 組細(xì)胞均未出現(xiàn)污染現(xiàn)象。

圖1 免過(guò)濾酶消化法提取細(xì)胞Fig.1 Fibroblasts were isolated using enzyme digestion without filtration

圖2 組織塊貼壁法提取成纖維細(xì)胞：組織塊接種后6～10 d，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞從瘢痕疙瘩組織塊中爬出Fig.2 Fibroblasts were isolated using tissue cultivation:There were fibroblasts around the keloid tissue in 6-10 days after plating

圖3 各組成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%所需時(shí)間Fig.3 The time required for cells to coat 80% of the bottom of the flasks in each group

2.2 成纖維細(xì)胞增殖活性

如圖4 所示，免過(guò)濾酶消化法所提取的細(xì)胞首次測(cè)得細(xì)胞相對(duì)增殖活性平均為0.86±0.12，24 h 后上升為1.31±0.17，細(xì)胞增殖活性增長(zhǎng)率為53.33%±11.16%。傳統(tǒng)酶消化法所提取的細(xì)胞首次測(cè)得細(xì)胞相對(duì)增殖活性平均為0.87±0.13，24 h 后上升為1.33±0.17，細(xì)胞增殖活性增長(zhǎng)率為52.00%±10.01%。組織塊貼壁法所提取的細(xì)胞首次測(cè)得細(xì)胞相對(duì)增殖活性平均為0.89±0.11，24 h 后上升為1.38±0.20，細(xì)胞增殖活性增長(zhǎng)率為54.67%±11.52%。3 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 各組細(xì)胞的24 h 細(xì)胞增殖活性增長(zhǎng)率Fig.4 The growth rate of 24 hours cell proliferation activity in each group

2.3 上清液羥脯氨酸含量

圖5 顯示，免過(guò)濾酶消化法所提取的細(xì)胞組24 h所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為6.49～11.06 μg/mL，平均（8.62±1.63）μg/mL。傳統(tǒng)酶消化法所提取的細(xì)胞組24 h 所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為5.77～12.50 μg/mL，平均（8.35±2.13）μg/mL。組織塊貼壁法所提取的細(xì)胞組24 h 所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為7.45～12.98 μg/mL，平均（9.13±1.80）μg/mL。3 組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖5 各組細(xì)胞的24 h 羥脯氨酸產(chǎn)生量Fig.5 The hydroxyproline content after 24 hours in each group

3 討論

常用的成纖維細(xì)胞提取方法，根據(jù)是否使用消化酶，可分為酶消化法與組織塊貼壁法。組織塊貼壁法是將剪碎的組織小塊貼附在培養(yǎng)瓶底部，待組織塊貼附相對(duì)牢固后緩慢加入培養(yǎng)基，讓組織塊內(nèi)的成纖維細(xì)胞緩慢爬出組織塊[2]。其培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，一般需等待1～2 周方有成纖維細(xì)胞逐漸從組織塊中爬出[3]。為加快組織塊中成纖維細(xì)胞的爬出速度，有研究采用胰蛋白酶對(duì)組織碎塊進(jìn)行消化，消化后再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。在胰蛋白酶的作用下，成纖維細(xì)胞與組織間的連接變?nèi)酰子谂莱鼋M織塊，在一定程度上縮短了原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。但該種改進(jìn)方式也增加了操作步驟，使程序更復(fù)雜、污染概率更高[4]。酶消化法過(guò)程也較為復(fù)雜，包括剪碎組織、酶消化、過(guò)濾消化液、離心去上清、接種等步驟[5]。尤其是過(guò)濾消化液這一步，對(duì)碎組織塊的消化程度要求較高。在操作過(guò)程中，由于組織量相對(duì)較多、消化液相對(duì)較少、組織塊剪碎程度不夠或消化時(shí)間不足等原因引起的組織塊消化不徹底，均可引起過(guò)濾困難、過(guò)濾時(shí)間長(zhǎng)。由于組織塊消化不徹底，濾過(guò)液內(nèi)的成纖維細(xì)胞也較少；甚至在一些消化程度較輕的情況下，消化液呈膠凍狀，以致無(wú)法進(jìn)行過(guò)濾。按照傳統(tǒng)酶消化法提取細(xì)胞，在發(fā)生濾過(guò)困難時(shí)，往往意味著該次細(xì)胞提取試驗(yàn)失敗。

傳統(tǒng)的酶消化法進(jìn)行過(guò)濾的目的是除去消化液中未消化徹底的組織碎屑[6]。然而，在經(jīng)消化液消化后，組織碎屑內(nèi)仍含有大量的成纖維細(xì)胞，而且成纖維細(xì)胞與組織間的連接變?nèi)?，更容易從組織塊中爬出。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原酶消化剩余的組織碎屑周圍存在串珠樣成纖維細(xì)胞貼附；并且組織碎屑內(nèi)也可以較快地長(zhǎng)出成纖維細(xì)胞。本研究采用的免過(guò)濾酶消化法可以說(shuō)是傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法的結(jié)合。消化剩余的組織碎屑在沉淀后就如貼壁培養(yǎng)法的組織塊，并且這種方法中成纖維細(xì)胞爬出的速度更快。在接種后第2～3 天，即可觀察到有成纖維細(xì)胞從沉淀的組織碎屑中爬出，爬出速度較組織塊貼壁法快很多[7]。另外，組織碎屑周圍單獨(dú)貼壁的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在這種理念指導(dǎo)下，即使消化程度較低的膠凍狀消化液，也可以不過(guò)濾，直接進(jìn)行離心后接種；而組織碎屑可隨換液、傳代等去除，方法同組織塊貼壁法。

在成纖維細(xì)胞提取過(guò)后，培養(yǎng)瓶中既有消化完全、獨(dú)立貼壁的細(xì)胞，也有組織碎屑內(nèi)爬出的細(xì)胞，所以成纖維細(xì)胞提取效率更高。本研究中免過(guò)濾酶消化法提取的成纖維細(xì)胞可以更快地長(zhǎng)滿瓶底，平均較傳統(tǒng)酶消化法節(jié)約（3.25±0.89）d，較組織塊貼壁法節(jié)約（9.50±1.64）d，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3 組細(xì)胞均未出現(xiàn)污染現(xiàn)象，并且3 組細(xì)胞的24 h 細(xì)胞增殖活性增長(zhǎng)率及羥脯氨酸產(chǎn)生量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。羥脯氨酸是合成膠原蛋白的特有材料，可間接反應(yīng)膠原蛋白的含量[8]。因此，使用免過(guò)濾酶消化法提取成纖維細(xì)胞也不會(huì)增加污染概率或?qū)Τ衫w維細(xì)胞增殖活性及膠原分泌功能產(chǎn)生明顯影響。

綜上所述，免過(guò)濾酶消化法較傳統(tǒng)酶消化法及組織塊貼壁法，可以更快地獲取足夠的成纖維細(xì)胞，其組織利用率更高，是一種簡(jiǎn)便易行的成纖維細(xì)胞提取方法。這種方法實(shí)驗(yàn)步驟少、操作難度低，不會(huì)增加污染概率或?qū)?xì)胞活性及膠原分泌功能產(chǎn)生明顯影響。另外，這種將不同的細(xì)胞提取方式相結(jié)合的理念，在未來(lái)也許可以運(yùn)用到其他細(xì)胞提取過(guò)程中。