郭雪，陳金素，許蕊蕊，王秀麗*

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021

桉葉油是桉樹葉油腺細胞分泌的一種植物精油，主要藥效成分包括桉葉油素、芳樟醇和α-蒎烯[1]。現(xiàn)代研究表明，桉葉油具有抗菌、消炎的作用，對炎癥反應的多個環(huán)節(jié)，如體內(nèi)炎性介質(zhì)釋放、毛細血管通透性增加等均有影響[2]，被廣泛用于治療肺結(jié)核、糖尿病、哮喘等疾病[3]。除此之外，桉葉油中還含有多種單萜類和倍半萜化合物及衍生物，這些萜類化合物均具有止血、止痛等作用[4]。

關于桉葉油的抗炎、抑菌、抗氧化和鎮(zhèn)痛止癢活性已有較多研究[5-12]，但未見基于“藥輔合一”的理念將桉葉油同時作為藥效物質(zhì)與油相、促透劑制成乳膏并對其抗炎、鎮(zhèn)痛及抑菌效果進行研究的報道。

本研究基于“藥之為輔”的設計應用規(guī)律，設計并優(yōu)化了桉葉油乳膏的處方工藝。處方中的桉葉油為具有抗炎、抗菌作用的油狀液體，替代乳膏中的有機溶劑充當油相，同時還可作為促透劑增加藥物的經(jīng)皮滲透性，兼有充當制劑油相、促進滲透與治療疾病的三重特點。

乳膏劑的基質(zhì)對皮膚表面分泌物的分泌和水分的蒸發(fā)影響較小，同時可以均勻溶解藥物有效成分，涂抹于皮膚后可以使有效成分均勻釋放，更好地發(fā)揮藥物療效。

鑒于此，本研究基于“藥輔合一”的理念篩選桉葉油乳膏處方工藝，既發(fā)揮桉葉油抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛止癢等藥理活性，又發(fā)揮其脂溶性和促滲透特性，拓展了桉葉油的應用范圍，為植物揮發(fā)油作為藥用輔料的進一步研究提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

FA1204B 型分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）；Sorall ST 8R 型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；SHHW21-600 型電熱三用水箱（北京醫(yī)療設備廠有限責任公司）；BCD-519WEZ50型TCL 電冰箱（TCL 家用電器有限公司）；101-1AB型電熱鼓風干燥箱（天津賽得利斯實驗儀器分析制造廠）；SDPTOP SZN 型解剖顯微鏡（尼康株式會社）；BBS-SDC 型超凈臺（濟南鑫貝西生物技術有限公司）；揮發(fā)油提取器（河南九和共創(chuàng)儀器有限公司）；打孔器（上海遠卓文教用品有限公司）。

1.2 試藥

硬脂酸（批號：CG10070082，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責任公司）；單硬脂酸甘油酯（批號：C10286479，上海麥克林生化科技有限公司）；甘油（批號：000619，北京化學試劑公司）；月桂氮?酮（批號：Z13J10Y93008，上海源葉生物科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：1202021，廣東省精細化學品工程技術研究開發(fā)中心）；桉葉油（吉安駿馬香料有限公司）；冰片（批號：76747220，上海邁瑞爾化學技術有限公司）；復方醋酸地塞米松乳膏（廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山何濟公制藥廠）；二甲苯（批號：20091020，重慶川東化工集團有限公司）；大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌（批號分別為19089037、17121207，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院）。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種小鼠120只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（BUCM-4-2019091004-3105），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房。

2 方法

2.1 Box-Behnken 響應面法優(yōu)選桉葉油乳膏基質(zhì)處方

2.1.1試驗設計 預試驗結(jié)果表明，桉葉油、硬脂酸及單硬脂酸甘油酯三者的用量會對桉葉油乳膏的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。因此，正式試驗中以桉葉油的用量（A）、硬脂酸的用量（B）和單硬脂酸甘油酯的用量（C）為自變量，以綜合評分（Y）為評價指標，每個因素設計高、中、低3個水平，見表1。

表1 Box-Behnken響應面法優(yōu)選桉葉油乳膏基質(zhì)處方試驗設計

2.1.2考察指標及評價方法 在桉葉油乳膏處方篩選過程中，將乳膏的外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性作為乳膏質(zhì)量評價的指標，綜合評分為5 個指標得分之和。各項指標的評價方法：1）外觀均一性。觀察桉葉油乳膏顏色、質(zhì)地是否均勻，靜置是否會產(chǎn)生分層現(xiàn)象；2）涂布延展性。觀察桉葉油乳膏涂布過程中有無結(jié)塊與顆粒；3）離心穩(wěn)定性。將桉葉油乳膏4000 r·min-1離心15 min（離心半徑為5 cm），觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象；4）耐寒穩(wěn)定性。取桉葉油乳膏于-20 ℃條件下放置24 h，取出放至室溫，觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象；5）耐熱穩(wěn)定性。取桉葉油乳膏置于50 ℃恒溫箱中，恒溫放置6 h，觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象[13]，具體評分標準見表2。

表2 桉葉油乳膏基質(zhì)評價標準

2.2 粒度測定

取3批桉葉油乳膏適量，涂成薄層，薄層面積相當于蓋玻片的面積，覆以蓋玻片，每個批號涂3 片，按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）附錄通則0982第一法測定。

2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗

昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機分為低、中、高劑量桉葉油乳膏組，陽性對照組及空白乳膏組5組，每組10 只。低、中、高劑量藥物組按小鼠體質(zhì)量分別在小鼠右耳耳廓給予桉葉油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1，陽性對照組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹復方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1，空白乳膏組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹空白乳膏1.0 g·kg-1，每天3次，連續(xù)3 d。第4 天涂藥1 h 后，對各組小鼠右耳給予二甲苯致炎，每只0.05 mL，1 h 后將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用直徑為8 mm打孔器將雙耳相同部位打下圓耳片，稱質(zhì)量，以左耳作對照，左右耳片質(zhì)量差為腫脹程度，計算各組腫脹度，求出腫脹抑制率。

2.4 熱板實驗

將熱板儀的溫度設置為（55.0±0.5）℃，將小鼠置于熱板儀上，觀察并記錄從小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足的時間，將此時間定義為該小鼠的痛閾值，5 s＜痛閾值＜30 s 的小鼠為合格。選取痛閾值合格的小鼠50 只，隨機分為低、中、高劑量桉葉油乳膏組、陽性對照組及空白乳膏組共5 組，每組10只。測定各組小鼠給藥前痛閾值，然后低、中、高劑量藥物組分別給予小鼠0.2、0.4、0.6 g/只桉葉油乳膏涂抹雙后足，陽性對照組小鼠給予0.2 g/只的復方醋酸地塞米松乳膏，空白乳膏組小鼠給予0.2 g/只的空白乳膏。然后進行指標檢測，連續(xù)給藥2 次，每次間隔0.5 h，在末次給藥1.0、1.5、2.0 h后測定其痛閾值，記錄小鼠給藥前后痛閾值并計算鎮(zhèn)痛率[14]。

2.5 體外抑菌試驗

從-80 ℃冰箱取凍存的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌種，室溫解凍，在安全柜中用滅菌后的接種環(huán)蘸取少量菌液，在已冷卻凝固的瓊脂板上劃線接種細菌，將劃線的瓊脂板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑選單個生長狀況良好的菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩，培養(yǎng)箱中孵育6 h，再用滅菌后的液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液吸光度為0.1后備用。

取無菌液體培養(yǎng)基20 mL 于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，室溫冷凝固化。取備用菌液50 μL，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，用直徑為6 mm的打孔器在中央位置打孔，并用所制高、中、低劑量的桉葉油乳膏填滿缺孔，密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出測量抑菌環(huán)直徑。每個劑量均設3個平行組。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以（）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 處方優(yōu)化試驗結(jié)果

3.1.1Box-Behnken 響應面法優(yōu)選處方試驗設計及結(jié)果 Box-Behnken 響應面法優(yōu)選處方試驗設計結(jié)果見表3。

表3 桉葉油乳膏基質(zhì)處方試驗設計與評分結(jié)果

3.1.2模型擬合 采用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對上述數(shù)據(jù)進行分析，以Y對自變量進行模型擬合，并通過相關系數(shù)（r）等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到回歸方程：Y=93.40+3.25A+1.38B+2.63C-3.50AB-6.00AC-9.75BC-7.08A2-6.82B2-10.82C2，方差分析見表4。由此可知，r=0.968 6，P＜0.01，F(xiàn)值為24.01，這表明模型具有極顯著差異性；失擬P=0.095 8＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，實驗誤差小，可用此模型對桉葉油乳膏處方進行分析和預測。

3.1.3響應面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評價指標隨因素變化的等高線圖和響應面圖（圖1～3）。

由圖1～3 可以看出，桉葉油、硬脂酸和單硬脂酸甘油酯三者的用量對綜合評分均呈拋物線形，即隨著三者用量的逐漸增大，綜合評分均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，因此，在桉葉油乳膏的制備工藝中適當增加三者的用量可以提高綜合評分。與此同時，由表4 可知，硬脂酸的用量對綜合評分的影響小于桉葉油與單硬脂酸甘油酯的用量對綜合評分的影響，隨著硬脂酸用量的增加，綜合評分先是升高，繼而緩慢降低，因此，在桉葉油乳膏的制備中應控制硬脂酸的用量在最佳范圍內(nèi)。

圖1 桉葉油用量和硬脂酸用量對綜合評分的影響

表4 桉葉油乳膏多元回歸模型方差分析結(jié)果

結(jié)合回歸模型分析和實際操作過程中的可行性，各因素值保留為1位小數(shù)，桉葉油乳膏的最優(yōu)基本基質(zhì)配方：桉葉油的用量為1.1 g、硬脂酸的用量為1.0 g、單硬脂酸甘油酯的用量為1.6 g。

3.2 乳膏的制備

將硬脂酸1.0 g、單硬脂酸甘油酯1.6 g、桉葉油1.1 g、月桂氮?酮0.13 g、冰片2.0 g 放置于容器內(nèi)，水浴加熱至熔化，繼續(xù)加熱至70～80 ℃；另取十二烷基硫酸鈉0.30 g、甘油0.75 g 和蒸餾水適量（加至乳膏總量10.0 g），加熱至70～80 ℃，緩緩倒入硬脂酸等油相中，邊加邊攪拌，至乳化完全，放冷即得?？瞻兹楦嗟闹苽涫菍⑻幏街械蔫袢~油用無藥效作用的中鏈甘油三酸酯代替。中劑量乳膏中，含桉葉油0.80 g，中鏈甘油三酸酯0.30 g。低劑量乳膏中，含桉葉油0.60 g，中鏈甘油三酸酯0.50 g。

3.3 粒徑考察結(jié)果

按照《中國藥典》2020 年版（四部）附錄通則0982 第一法測定粒徑，3 批樣品均未檢出＞180 μm的粒子，結(jié)果見圖4。

圖4 3批桉葉油乳膏在40倍鏡下的乳粒

3.4 桉葉油乳膏對二甲苯致炎反應的影響

結(jié)果表明，與空白乳膏組相比，低、中、高劑量桉葉油乳膏組及陽性對照組小鼠耳廓腫脹度均有明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。表明桉葉油乳膏能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥，隨著藥物劑量的增大，抗炎效果逐漸增強，即具有劑量依賴性，且高劑量組的抗炎效果優(yōu)于陽性對照組，提示桉葉油乳膏具有明顯抗炎的作用，結(jié)果見表5。

表5 桉葉油乳膏對小鼠的抗炎作用結(jié)果（,n=10）

表5 桉葉油乳膏對小鼠的抗炎作用結(jié)果（,n=10）

注：與空白乳膏組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；表6同。

圖2 桉葉油用量和單硬脂酸甘油酯用量對綜合評分的影響

圖3 硬脂酸用量和單硬脂酸甘油酯用量對綜合評分的影響

3.5 桉葉油乳膏對物理性致痛的影響

結(jié)果表明，高劑量和中劑量的桉葉油乳膏都能明顯提高小鼠的痛閾值，提高小鼠對熱板的耐受力，2 個劑量組都與空白乳膏組有明顯差異，且中劑量組提高小鼠通閾值的能力與陽性對照組相當，高劑量組優(yōu)于陽性對照組，順序為高劑量組＞陽性對照組＞中劑量組＞低劑量組，具體結(jié)果見表6。

表6 桉葉油乳膏對小鼠的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果（,n=10）

表6 桉葉油乳膏對小鼠的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果（,n=10）

3.6 桉葉油乳膏體外抑菌效果

抑菌圈直徑6 mm即為與打孔器直徑相同，無抑菌作用。抑菌圈直徑越大，抑菌作用越強。當給予低劑量桉葉油乳膏時，其對大腸埃希氏菌的抑菌圈只有6.22 mm，有微弱的抑菌作用，而中高劑量的桉葉油乳膏對大腸埃希氏菌的抑菌圈明顯增大。相比于大腸埃希氏菌，桉葉油乳膏對金黃色葡萄球菌的抑制作用有所增強，高劑量組抑菌圈能達到9.50 mm，抑菌效果明顯，結(jié)果見表7。

表7 桉葉油乳膏抑菌作用（,n=3）

表7 桉葉油乳膏抑菌作用（,n=3）

4 討論

角質(zhì)層主要由角質(zhì)細胞和大量填充于細胞間隙的類脂組成，是藥物透皮吸收的主要屏障。桉葉油的主要成分1,8-桉葉素為無色或黃色澄清液體，化學性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的脂溶性，容易穿透生物膜結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有研究表明，桉葉油是通過改變角質(zhì)細胞間類脂雙分子層結(jié)構(gòu)，增加其紊亂程度從而促進藥物滲透的[15]。因此，桉葉油不僅作為主要的有效成分在乳膏中發(fā)揮了抗炎、鎮(zhèn)痛與抑菌的作用，還作為乳膏的主要油相基質(zhì)與促透劑起到了構(gòu)建乳膏與促進乳膏透皮吸收的作用。

從制劑角度看，桉葉油特殊的理化性質(zhì)在桉葉油乳膏中充當了輔料角色，充分利用其脂溶性、抑菌劑和促透劑的功能特征，輔助制劑的成型、滲透與穩(wěn)定，減少了化學輔料在乳膏中的應用，提高了制劑的安全性和患者的順應性，一舉多得；從治療角度看，桉葉油可以發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，符合“藥輔合一”的理論內(nèi)涵，為桉葉油的開發(fā)和醫(yī)用提供了廣闊前景。

5 結(jié)論

綜上所述，本研究通過二甲苯致小鼠耳腫脹、熱板儀小鼠致痛及大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制實驗探討了桉葉油乳膏的抗炎、鎮(zhèn)痛及抑菌的藥理作用。由實驗結(jié)果可知，本研究所制桉葉油乳膏的抗二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥作用優(yōu)于臨床上常用的消炎止癢藥方醋酸地塞米松乳膏，且可明顯提高小鼠痛閾值，效果同樣優(yōu)于陽性對照組。抑菌實驗表明，桉葉油乳膏對金黃色葡萄球菌與大腸埃希氏菌均有一定程度的抑制作用。桉葉油乳膏抗炎、鎮(zhèn)痛作用優(yōu)良，且兼具一定的抑菌作用。