王大鵬，郭英華，劉 源，齊 欣，蘇曉磊，王俊峰，劉長庭*

（1. 中國人民解放軍總醫(yī)院 第二醫(yī)學(xué)中心，北京 100853； 2. 中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院，三亞 572000）

0 引言

近20 年來，細(xì)菌生物膜一直被認(rèn)為是太空飛行過程中航天器材料腐蝕持續(xù)存在的關(guān)鍵因素?？臻g環(huán)境中微重力、溫度交變和粒子輻射等因素可誘導(dǎo)細(xì)菌的生物學(xué)性狀發(fā)生改變，使得細(xì)菌的DNA 損傷修復(fù)能力下降、耐藥性增加和生物膜形成能力增強(qiáng)等，其中細(xì)菌生物膜形成能力增強(qiáng)對航天器材料的危害是目前的研究熱點(diǎn)之一。細(xì)菌生長及代謝會在航天器材料表面形成生物膜，促成了對材料的腐蝕。研究表明：空間微重力環(huán)境會促使銅綠假單胞菌的生物被膜生長速率加快，使大腸桿菌生物被膜的厚度增加；在空間環(huán)境下細(xì)菌生物膜厚度的增加可能與細(xì)菌胞外聚合物增多有關(guān)，而胞外聚合物可影響細(xì)菌生物膜的厚度和穩(wěn)定性。材料表面的細(xì)菌生物膜同時也是抗菌劑的天然屏障，可產(chǎn)生抗腐蝕阻抗效應(yīng)。生物膜中細(xì)菌的形態(tài)和生理作用均與浮游細(xì)菌不同，并且細(xì)菌生物膜對消毒劑的耐受性通常高出浮游細(xì)菌幾個數(shù)量級，這是細(xì)菌生物膜危害性更強(qiáng)的主要原因。

細(xì)菌本質(zhì)上都是水生生物，存活的環(huán)境需要有液態(tài)水。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌正常生長周期的一部分，存在于多糖、細(xì)胞外基質(zhì)中。細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生受到RpoS 基因編碼的產(chǎn)物σs 控制，細(xì)菌生物膜的相關(guān)信號分子一旦被激活，生物膜的形成和增厚過程就可能加快。航天器內(nèi)細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生通常與水凈化系統(tǒng)和熱交換器有關(guān)，并可能通過儲箱中的冷凝系統(tǒng)污染或腐蝕存儲設(shè)施。 空間站中濕度及溫度等環(huán)境條件適宜，有利于細(xì)菌的迅速繁殖和生物膜的形成。“和平號”空間站以及國際空間站都面臨細(xì)菌生物膜堆積帶來的工程挑戰(zhàn)。細(xì)菌生物膜不僅會腐蝕航天器設(shè)備材料，還可能會引起航天員的宿主免疫反應(yīng)受損，被感染的機(jī)會增加，從而威脅航天員健康。因此，了解細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制并采取有效的監(jiān)控及防護(hù)措施有重要意義。

本文綜述細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制以及可能對航天器材料造成的危害，給出細(xì)菌生物膜的檢測和評價方法，重點(diǎn)關(guān)注空間環(huán)境下細(xì)菌生物膜對航天器材料腐蝕相應(yīng)的防護(hù)措施。

1 細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)與形成機(jī)制

細(xì)菌生物膜是細(xì)菌被包裹在其自身分泌的多聚物等物質(zhì)中所形成的膜狀細(xì)菌群體，是細(xì)菌抵抗外界復(fù)雜環(huán)境的一種自我保護(hù)形式。細(xì)菌生物膜是有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)菌細(xì)胞群體（見圖1），主要成分為細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)菌分泌的胞外聚合物（EPS），包括胞外多糖、蛋白質(zhì)及各類酶等。其中，胞外多糖猶如一個框架，維持細(xì)菌生物膜的完整性，支持菌體細(xì)胞、菌體之間互相黏連附著在框架表面，并支持細(xì)菌之間借助框架相互交流信息。細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)具有不同一性，這是因?yàn)榧?xì)菌所處微環(huán)境不同，導(dǎo)致相同的細(xì)菌其基因表達(dá)不同。因此，不同細(xì)菌或同種細(xì)菌所處環(huán)境不同時形成的細(xì)菌生物膜也會存在結(jié)構(gòu)差異。盡管人們做了很多關(guān)于細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)方面的研究，但對其結(jié)構(gòu)的變化仍不十分清楚。

圖1 細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of biofilm

細(xì)菌生物膜的形成是一個動態(tài)過程，總的來說要經(jīng)歷黏附、發(fā)展和成熟3 個階段。在黏附階段，細(xì)菌缺乏成熟生物膜結(jié)構(gòu)保護(hù)，抗逆性不強(qiáng)。黏附對于細(xì)菌生物膜的形成尤為重要，因此在此階段更容易限制細(xì)菌生物膜的形成。發(fā)展階段是眾多浮游菌落形成進(jìn)而連接成大的擴(kuò)散性結(jié)構(gòu)的過程（見圖2）。當(dāng)浮游菌落擴(kuò)大到一定程度，細(xì)菌生物膜就進(jìn)入了成熟階段。該階段涉及多種信號傳導(dǎo)的調(diào)控過程，需要多種遺傳因子參與。已發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌生物膜成熟過程中有大量的胞外多糖產(chǎn)生，這說明介導(dǎo)成熟階段菌體聚集的黏附因子可能是胞外多糖。黏附是生物膜形成的開始，但主動擴(kuò)散不是終點(diǎn)，而是下一輪生物膜形成的開始。

圖2 生物膜形成機(jī)制Fig. 2 The formation process of biofilm

2 細(xì)菌生物膜對航天器材料的危害

細(xì)菌生物膜主要作用于航天器材料界面，對其造成腐蝕，腐蝕程度由界面的理化因素決定，如氧氣和鹽的含量、pH 值、氧化還原電位和電阻等，這些因素都受到生長于界面上的細(xì)菌的影響，即細(xì)菌腐蝕——腐蝕體系中存在的與細(xì)菌作用有關(guān)的金屬腐蝕。細(xì)菌之所以參與腐蝕過程，是由細(xì)菌自身的特點(diǎn)決定的。細(xì)菌的生長需要水、電子供體和受體、能量和碳源等。對于金屬材料而言，由于細(xì)菌新陳代謝，在金屬表面形成的膜電阻發(fā)生了變化，創(chuàng)造膜內(nèi)腐蝕環(huán)境。根據(jù)呼吸底物和電子受體的不同，可將腐蝕金屬的微生物進(jìn)行分類，如硫酸鹽還原細(xì)菌、鐵細(xì)菌、錳細(xì)菌，以及產(chǎn)生有機(jī)物和胞外多聚物/薄膜的細(xì)菌。這些細(xì)菌常常共存于自然發(fā)生的細(xì)菌生物膜中，協(xié)同啟動并影響到金屬材料的電化學(xué)過程。細(xì)菌生物膜的胞外基質(zhì)成分含有95%～97%的水，提供細(xì)菌群落穩(wěn)定的生存環(huán)境，在生態(tài)環(huán)境中占優(yōu)勢地位。細(xì)菌生物膜的存活方式是一個永無止境的循環(huán)，在這一動態(tài)過程中，特定的酶參與了細(xì)菌生物膜的降解和重構(gòu)，不僅導(dǎo)致部分基質(zhì)降解，還導(dǎo)致生物膜的主動擴(kuò)散和隨后的表面再聚集。這預(yù)示了細(xì)菌生物膜的持續(xù)再循環(huán)賦予細(xì)菌適應(yīng)各種極端環(huán)境的能力。因此，空間環(huán)境下航天器材料表面的細(xì)菌生物膜一旦形成，造成的腐蝕也會進(jìn)一步加快，大大縮短其使用壽命。

3 細(xì)菌生物膜的主要檢測與評價方法

材料表面典型的細(xì)菌生物膜通常具有薄層、黏液狀、柔軟濕潤、散發(fā)有機(jī)物味道和色澤變深等特征，但如果與腐蝕產(chǎn)物、碳水化合物及抗腐蝕物質(zhì)吸附在一起，這些典型的特征就很難辨認(rèn)。因此，能否精確檢測出是否存在細(xì)菌生物膜十分重要。排除存在細(xì)菌生物膜的基本條件包括：材料表面工作溫度超過80 ℃；表面干燥，不產(chǎn)生任何水汽；不存在有機(jī)/無機(jī)營養(yǎng)物；定期采用有效防污措施的部位。

對細(xì)菌生物膜的評估，一般采用定量或定性的方法。細(xì)菌生物膜（半）定量檢測方法分為直接方法和間接方法。直接方法包括通過平板計(jì)數(shù)活細(xì)胞（菌落形成單位，CFU 計(jì)數(shù)）、流式的細(xì)胞計(jì)數(shù)，或可能使用熒光染料的光學(xué)和熒光顯微鏡。間接方法包括結(jié)晶紫染色、dry mass 染色或resazurin 染色。對于細(xì)菌生物膜的定性分析，掃描電子顯微鏡（SEM）和共焦激光掃描顯微鏡（CLSM）通常是首選，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的放大化和可視化。另外，DNA 測序技術(shù)可以直接評估細(xì)菌生物膜的特性：對特定環(huán)境中提取的核酸進(jìn)行測序，通過獲得的DNA 序列可知有關(guān)細(xì)菌生物膜的特性以及他們?nèi)绾闻c其他已知細(xì)菌發(fā)出信息，同時也可以通過分子測定追溯到污染源。雖然細(xì)菌生物膜的評估方法有很多種，如果只選擇一種方法則結(jié)果會有一定的偏差。因此，為避免出現(xiàn)誤導(dǎo)性結(jié)果，建議至少使用兩種評估方法。評估方法的合理選擇和優(yōu)化，對于細(xì)菌生物膜的精確評估、其形成及形態(tài)變化的分析，以及可對抗細(xì)菌生物膜材料的選擇有非常重要的意義。

4 空間環(huán)境細(xì)菌生物膜的防控策略

對于空間環(huán)境下細(xì)菌生物膜的消殺措施主要有物理殺菌、化學(xué)殺菌和生物控制法。物理方法包括紫外線和電磁場殺菌方法：紫外線波長較短，可殺滅細(xì)菌且對細(xì)菌繁殖、生長等有抑制作用；電磁場殺菌是利用電磁場使細(xì)菌細(xì)胞中的原生質(zhì)產(chǎn)生劇烈振蕩，影響細(xì)胞的正常代謝，從而殺滅細(xì)菌?；瘜W(xué)殺菌方法是指使用氧化性殺菌劑和非氧化性殺菌劑來殺滅細(xì)菌。氧化殺菌劑通過與細(xì)菌體內(nèi)代謝酶發(fā)生氧化作用來降低微生物活性，使得酶被破壞，從而抑制微生物的繁殖，其中最具代表性的強(qiáng)氧化劑是臭氧，其對于密閉環(huán)境中水系統(tǒng)的殺菌處理效果尤為明顯；非氧化性殺菌劑是以致毒劑的方式作用于微生物的特殊部位，從而破壞微生物的細(xì)胞，達(dá)到殺菌效果。生物控制法是目前非常有前景的防護(hù)措施，主要是采用噬菌體殺菌。噬菌體是一種病毒，可寄生在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，其殺菌原理可能是通過其兩性多肽結(jié)構(gòu)增加細(xì)菌外膜通透性，輔助酶解催化域進(jìn)入其中降解肽聚糖，使得細(xì)菌不易在表面定植形成生物膜。

在太空飛行背景下使用消殺策略，有兩個問題需要解決：一是質(zhì)量限制措施使得配備的殺菌劑都是高濃度的，如何使其可方便地在低濃度下使用；另外是對殺菌劑的使用，尤其是臭氧，作為氣態(tài)和揮發(fā)性化合物的代表，不僅需要考慮其對設(shè)備的殺菌效果，還要兼顧其對航天員安全的影響。

針對空間站等密閉艙室，開發(fā)和實(shí)施一種改進(jìn)的細(xì)菌生物膜控制方法是目前研究重點(diǎn)。國際空間站系統(tǒng)在運(yùn)行初始就控制住了水循環(huán)系統(tǒng)的生物膜生長，而不是試圖通過破壞或分離現(xiàn)有生物膜來重新控制。雖然已確定大部分生物膜問題是與航天器水循環(huán)系統(tǒng)組件有關(guān)，但有部分研究認(rèn)為也可能是微生物在易于冷凝或吸收水的表面上生長引起的，也就是說在航天器密閉艙內(nèi)一些表面易積水的材料上容易形成生物膜。為此有學(xué)者提出一種假設(shè)的防控策略——將具有揮發(fā)性的有機(jī)化合物凝結(jié)到容易積水的材料上來控制生物膜的生長。因此，評估、預(yù)防或清除水分聚集，可以控制細(xì)菌生物膜的形成。

研究表明，細(xì)菌生物膜對單一的化合物有潛在的耐藥性及抵抗性，這可采用多種化合物的相容性策略來緩解。因此對于航天器密閉艙內(nèi)的設(shè)備，通過制作多種化合物合成的材料來降低細(xì)菌生物膜對設(shè)備及材料的腐蝕或是未來研究的重點(diǎn)。

設(shè)備表面使用涂料可以控制生物膜的形成，減少生物腐蝕。目前對于空間環(huán)境下航天器設(shè)備與材料的細(xì)菌生物膜控制研究更多集中于潤滑劑在設(shè)備材料表面的應(yīng)用。潤滑劑具有兩種修飾結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)不僅可以減少初始細(xì)菌的黏附，干擾表面的運(yùn)動，還可以提高材料磨損表面的修復(fù)功能，增加材料表面的光潔度，尤為重要的是潤滑劑通常不與含有微生物的液體結(jié)合。潤滑劑在生物膜預(yù)防方面已顯示出廣闊前景，但目前的技術(shù)僅局限于在涂層中加入潤滑劑來抑制化合物的釋放，而使用涂層技術(shù)所面臨的主要問題包括需要保持長期有效性以及飲用水中所釋放的化合物的毒性問題，同時還需要兼顧到涂層材料與潤滑劑的相容性。

細(xì)菌生物膜在不同環(huán)境中生長代謝不同。環(huán)境中多種細(xì)菌生物膜相互作用的復(fù)雜性，可能導(dǎo)致即使是同一種細(xì)菌生物膜也會出現(xiàn)對于同種材料的腐蝕行為不同。因此實(shí)際情況往往是幾種傳導(dǎo)途徑以不同的方式在腐蝕過程中共同起作用。這與代謝物所處的地點(diǎn)或周圍的環(huán)境條件密切相關(guān)。實(shí)際上，代謝互補(bǔ)在細(xì)菌生物膜的腐蝕過程中起著重要作用。例如，在缺氧環(huán)境下所發(fā)生腐蝕過程，就是由于發(fā)酵細(xì)菌和與嗜熱類δ 蛋白細(xì)菌一起的合成氫而引起的腐蝕（如圖3 所示）。在空間環(huán)境下，腐蝕性細(xì)菌形成的生物膜加快了腐蝕的發(fā)生。研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生的EPS 可以在生物膜中保持較高的滲透壓，從而增強(qiáng)生物膜吸收外界養(yǎng)分的能力，驅(qū)動生物膜擴(kuò)張。 因此，如何調(diào)節(jié)生物膜的滲透壓以控制有害生物膜的形成，同時增強(qiáng)有益生物膜的形成，應(yīng)成為航天器材料細(xì)菌生物膜腐蝕的控制策略之一，這也可能是未來新的研究重點(diǎn)。

圖3 金屬表面生物膜作用的描述模型Fig. 3 Descriptive model of biofilm acted on metal surface

5 總結(jié)與建議

隨著載人航天技術(shù)的飛速發(fā)展，空間載人密閉艙室內(nèi)由細(xì)菌生物膜引起的材料腐蝕問題越來越受到重視。深入研究細(xì)菌生物膜對航天器內(nèi)部材料的生物腐蝕機(jī)制，探索航天器在長期空間飛行下的細(xì)菌生物膜的防控技術(shù)，有助于保障航天器的長期安全運(yùn)行，是載人航天的重大課題之一。細(xì)菌生物膜引起的污染或腐蝕可能與以下因素密切相關(guān)：航天器材料表面的化學(xué)成分，細(xì)菌生物膜固有的生物降解傾向，細(xì)菌生物膜與可能最終加速生物腐蝕過程的細(xì)菌的接觸。雖然CLSM、DNA 測序等技術(shù)為細(xì)菌生物膜的評估鑒別提供了高效的路徑，但是細(xì)菌生物膜引起的腐蝕問題仍是現(xiàn)階段研究難點(diǎn)之一。因此，針對細(xì)菌生物膜特點(diǎn)設(shè)計(jì)抗膜策略，可為防護(hù)細(xì)菌生物膜引發(fā)的航天器材料的腐蝕提供有效手段。

生物腐蝕是一個非常復(fù)雜的過程，關(guān)于細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。清楚地了解細(xì)菌生物膜形成過程的細(xì)節(jié)及其信號通路的調(diào)節(jié)，有助于開發(fā)小分子、肽或蛋白質(zhì)抑制劑，以產(chǎn)生特殊的抗生物膜作用。通過設(shè)計(jì)具有結(jié)構(gòu)修飾的合成衍生物，可以開發(fā)更有效的抑制劑或改變應(yīng)用方法，實(shí)現(xiàn)有害生物膜的快速消除。綜合細(xì)菌生物膜的防控策略，主要有以下3 種：1）改變易感表面的特性以防止生物膜形成；2） 調(diào)節(jié)信號通路以抑制生物膜的形成；3） 施加外力以消除生物膜。未來對細(xì)菌生物膜控制的研究可能需要多學(xué)科、多專業(yè)協(xié)同開展，以探索更有效的細(xì)菌生物膜的預(yù)防、抑制和根除策略。