王喜鳥，姚文慧，潘珍珍，董潔炎，劉 碩，丁選勝

（中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 211198）

糖尿病是以胰島素分泌不足和糖脂代謝紊亂為特征的異質(zhì)性慢性代謝疾病，常伴隨多種血管并發(fā)癥，具有高患病率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)。2020 年中國成人糖尿病流行病學(xué)最新數(shù)據(jù)顯示［1］，中國大陸糖尿病患病率逐年增加，患者總數(shù)約為1.298 億。糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者發(fā)病率、住院率和病死率增加的主要原因［2］。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是從傳統(tǒng)中藥淫羊藿中提取的淫羊藿總黃酮的主要有效成分之一，相對(duì)分子質(zhì)量為676.662，難溶于水。ICA 具有多種生物活性，如抗腫瘤［3］、抗骨質(zhì)疏松［4］、抗抑郁癥［5］、改善阿爾茨海默病認(rèn)知功能［6］等。此外，研究顯示ICA 對(duì)糖尿病［7］及糖尿病并發(fā)癥［8］、血管內(nèi)皮功能紊亂［9-10］均有一定療效，但I(xiàn)CA 在糖尿病早期血管功能障礙中的作用尚未有研究，其改善血管內(nèi)皮功能的分子機(jī)制尚未清楚闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)主要考察ICA 對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的血管內(nèi)皮舒縮功能的保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制，為揭示糖尿病血管并發(fā)癥的病理機(jī)制及創(chuàng)新藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品及試劑

淫羊藿苷（icariin，ICA，純度大于98%，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：18102102），ICA 藥液配制方法：稱取ICA 粉末480 mg 于研缽中研磨，使其溶于0.5% CMC-Na 40 mL 溶液中，即為ICA 高劑量混懸液，取此混懸液20 mL 加入0.5% CMC-Na溶液20 mL 稀釋混勻即為ICA 低劑量混懸液。四氧嘧啶（alloxan）、硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）、氯化乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）（Macklin公司）；鹽酸去氧腎上腺素（phenylephrine，Phe，Aladdin 公司）；氯化鉀（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；p38 MAPK、GAPDH 抗體（Protein Tech 公司）；p-p38 MAPK抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；eNOS 抗體（沈陽萬類生物有限公司）；p-eNOS抗體（百遠(yuǎn)生物科技有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

SYC超級(jí)恒溫水槽（南京科爾儀器設(shè)備公司）；Medlab-U/4C501H 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）；EPS300 電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞株

SPF 級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重（20 ± 2）g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。

2 方 法

2.1 四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的建立

雄性昆明種小鼠24 只，體重18~22 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)挑選6 只小鼠作為正常對(duì)照組（control），其余小鼠用于造模。造模方法：將所有待造模小鼠禁食不禁水12 h 后，按200 mg/kg 的劑量腹腔注射2%四氧嘧啶溶液（將四氧嘧啶溶于無菌生理鹽水，現(xiàn)用現(xiàn)配），對(duì)照組小鼠注射等同體積的生理鹽水。造模72 h 后，將所有小鼠禁食不禁水8 h，取小鼠尾靜脈血用血糖儀測(cè)定小鼠空腹血糖，隨即挑選血糖大于等于11.1 mmol/L 的小鼠納入糖尿病模型［11］。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將造模成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組：模型組（model）、ICA 低劑量組（ICA-L，60 mg/kg）和ICA高劑量組（ICA-H，120 mg/kg）。每日灌胃給藥1 次，ICA 的給藥容積為0.1 mL/10 g 體重，連續(xù)給藥2周。

2.3 小鼠血糖、體重、攝食量及飲水量記錄

分別于給藥前、給藥2周后用血糖儀測(cè)定各組小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。每日記錄各組小鼠體重，計(jì)算各組小鼠的攝食量和飲水量，觀察各組小鼠的體重、攝食量和飲水量變化情況。

2.4 小鼠離體胸主動(dòng)脈血管舒縮功能的測(cè)定

2.4.1 胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制備 各組小鼠脫頸椎處死后，分離胸主動(dòng)脈并立即置于預(yù)冷（4 ℃）的K-H液中，去除外周結(jié)締組織并分離周圍脂肪后將血管剪成3~4 mm 長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)，小心地將其穿于2根不銹鋼鉤上，再懸掛于盛有K-H 液的浴皿內(nèi)，下端鋼絲用另一不銹鋼鉤固定，上端連接張力換能器，浴皿中持續(xù)通入O2，氣泡以每秒3~5 個(gè)為宜，連接恒溫水槽以保持（37±0.5）℃的恒溫狀態(tài)，將張力換能器連接至多道生理記錄儀，調(diào)節(jié)胸主動(dòng)脈血管環(huán)靜息張力為500 mg 后，每隔15 分鐘更換一次K-H 液進(jìn)行平衡，平衡1 h 后向浴皿中加入Phe（1 × 10-6mol/L）預(yù)收縮兩次，待洗脫至基線后開始后續(xù)試驗(yàn)。

2.4.2 ICA 對(duì)Ach 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張效應(yīng)的影響 各組小鼠動(dòng)脈環(huán)平衡后，向浴皿中加入Phe（1×10-6mol/L）使動(dòng)脈環(huán)收縮至基線，再分別累計(jì)加入不同濃度的Ach，使浴皿中Ach 的終濃度分別為1×10-9、1×10-8.5、1×10-8、1×10-7.5、1 × 10-7、1 × 10-6.5、1 × 10-6、1 × 10-5.5、1 × 10-5mol/L，記錄血管舒張幅度。

2.4.3 ICA 對(duì)SNP 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張效應(yīng)的影響 各組小鼠動(dòng)脈環(huán)平衡后，向浴皿中加入Phe（1×10-6mol/L）使動(dòng)脈環(huán)收縮至基線，再分別累計(jì)加入不同濃度的SNP，使浴皿中SNP 的終濃度分別為1 × 10-10、1 × 10-9.5、1 × 10-9、1 × 10-8.5、1 × 10-8、1 × 10-7.5、1 × 10-7、1 × 10-6.5、1 ×10-6mol/L，記錄血管舒張幅度。

2.4.4 ICA 對(duì)Phe 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)的影響 各組小鼠動(dòng)脈環(huán)平衡后，分別累計(jì)加入不同濃度的Phe，使浴皿中Phe 的終濃度分別為1 × 10-9、1 × 10-8.5、1 × 10-8、1 × 10-7.5、1×10-7、1×10-6.5、1×10-6、1×10-5.5、1×10-5mol/L，記錄血管收縮幅度。

2.4.5 ICA 對(duì)KCl 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)的影響 各組小鼠動(dòng)脈環(huán)平衡后，分別累計(jì)加入不同濃度的KCl，使浴皿中KCl 的終濃度分別為10，20，40，60，80，100 mmol/L，分別記錄血管收縮幅度。

2.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs 細(xì)胞，接種于6 孔板中，貼壁后換為無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基饑餓24 h。細(xì)胞分為4 組：正常組（Control）、高糖組（35 mmol/L 高糖，HG）、ICA-L（35 mmol/L HG +10 μmol/L ICA）、ICA-H（35 mmol/L HG+30 μmol/L ICA），分別用高糖和ICA 處理48 h 后收集細(xì)胞，經(jīng)RIPA 裂解液裂解細(xì)胞15 min，12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果將4 組細(xì)胞裂解液濃度調(diào)至一致，分別加入5 × SDS PAGE 上樣緩沖液，渦旋混勻，金屬浴95 ℃煮10 min。蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后置于10%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；TBST 洗去牛奶后，先后孵育抗eNOS（1∶1 000）、peNOS（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）。用高敏ECL發(fā)光液孵育條帶并顯影，采集的圖片采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。蛋白表達(dá)量采用灰度校正值顯示（各條帶灰度/GAPDH灰度）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)結(jié)果使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，n表示樣本數(shù)。柱狀圖和折線圖采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制。

3 結(jié) 果

3.1 ICA 對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖、體重、攝食量、飲水量的影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠的體重自給藥第2 天開始逐漸降低，給藥2 周后較正常組極顯著性降低（P＜0.001），ICA高低劑量組均明顯抑制小鼠體重減輕（P＜0.001），結(jié)果見圖1。

給藥2 周后，與正常組相比，模型組小鼠的空腹血糖、攝食量和飲水量均有明顯增加。ICA-L 和ICA-H組可以顯著改善糖尿病小鼠的飲水量增多，對(duì)空腹血糖和攝食量有一定改善作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表1。

Figure 1 Effect of icariin on body weight in alloxan-induced diabetic mice（± s,n = 6）

Table 1 Effects of icariin(ICA)on fasting blood glucose(FBG),food intake and water intake in alloxan-induced diabetic mice(± s,n = 6)

Table 1 Effects of icariin(ICA)on fasting blood glucose(FBG),food intake and water intake in alloxan-induced diabetic mice(± s,n = 6)

*P ＜0.05, **P ＜0.01,***P ＜0.001 vs control group; #P ＜0.05, ###P ＜0.001 vs model group; $$P ＜0.01 vs ICA-L group

Group Control Model ICA-L ICA-H Dose/（mg/kg）--60 120 FBG/（mmol/L）6.67±1.76 24.95±1.46***23.38±7.76**19.52±8.54*Food intake/（g/10 g）1.76±0.28 2.40±0.64**2.12±0.23**2.24±0.27***Water intake/（mL/10 g）3.05±1.04 9.16±2.34***6.46±0.99***###7.69±1.03***#$$

3.2 ICA 對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒縮功能的影響

3.2.1 ICA 對(duì)Ach 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張效應(yīng)的影響 與正常組相比，糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)Ach 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，ICA（60 mg/kg）給藥后可以一定程度上提高Ach 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈舒張率，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ICA（120 mg/kg）給藥后顯著改善Ach 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈舒張反應(yīng)（P＜0.01），結(jié)果見圖2。

3.2.2 ICA 對(duì)SNP 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張效應(yīng)的影響 ICA 對(duì)SNP 誘導(dǎo)的小鼠胸主動(dòng)脈舒張?jiān)囼?yàn)結(jié)果顯示，各組之間不同誘導(dǎo)劑量的舒張率無顯著性差異，說明四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血管非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)受損不明顯（P＞0.05），結(jié)果見圖3。

Figure 2 Effect of icariin on Ach induced vasodilation of aortas in alloxan-induced diabetic mice（± s,n = 6）

3.2.3 ICA 對(duì)Phe 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)的影響 與正常組相比，模型組、ICA-L和ICA-H組小鼠隨誘導(dǎo)劑量的增加收縮率逐漸上升，差異具有極顯著性（P＜0.001）。與模型組相比，ICA（60 mg/kg）給藥后可以一定程度上降低Phe 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈收縮率，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；ICA（120 mg/kg）給藥后顯著降低Phe 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈收縮（P＜0.05）；說明ICA（120 mg/kg）可以改善糖尿病狀態(tài)下Phe 誘導(dǎo)的小鼠胸主動(dòng)脈收縮，結(jié)果見圖4。

Figure 3 Effect of icariin on sodium nitroprusside (SNP) induced vasodilation of aortas in alloxan-induced diabetic mice（± s,n = 6）

Figure 4 Effect of icariin on phenylephrine (Phe) induced vascular contraction response of aortas in alloxan-induced diabetic mice（xˉ±s,n = 6）

3.2.4 ICA 對(duì)KCl 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮效應(yīng)的影響 ICA 對(duì)KCl 誘導(dǎo)的雄性小鼠胸主動(dòng)脈收縮效應(yīng)的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠胸主動(dòng)脈隨KCl誘導(dǎo)劑量的增加收縮率逐漸升高，呈極顯著性差異（P＜0.001）。ICA-L和ICA-H組小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)KCl誘導(dǎo)的收縮功能有一定改善作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），結(jié)果見圖5。

Figure 5 Effect of icariin on KCl induced vascular contraction response of aortas in alloxan-induced diabetic mice（± s,n = 6）

3.3 ICA 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞中p38 MAPK/eNOS信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，各組之間p38 MAPK和eNOS 的總蛋白含量無明顯差異。與正常組比較，高糖組p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），p-eNOS 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與高糖組相比，ICA（10 μmol/L）給藥組的p38 MAPK磷酸化水平有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），eNOS 磷酸化水平上調(diào)（P＜0.05）；ICA（30 μmol/L）給藥組可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的p38 MAPK 磷酸化（P＜0.01），并且顯著提高eNOS 的磷酸化水平（P＜0.001），結(jié)果見圖6。

Figure 6 Effect of icariin on p38 MAPK/eNOS signaling pathway in high glucose-induced HUVECs（± s,n = 3）

4 討 論

糖尿病導(dǎo)致的微血管和大血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者發(fā)病率和病死率升高的主要原因［12］。糖尿病導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵和起始因素［13］，是血管損傷的最早期反應(yīng)［14］。ICA 可以通過調(diào)節(jié)PRMT/ADMA/DDAH（蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶/不對(duì)稱二甲基精氨酸/二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶）通路改善ApoE（-/-）小鼠的內(nèi)皮功能［15］，也可以改善高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙，與其抑制p38/CREB 通路、激活A(yù)kt/eNOS/NO 通路有關(guān)［10］。此外，研究表明ICA 可以通過抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激改善糖尿病腎病狀態(tài)下Ach 誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈舒張和Phe 誘導(dǎo)的收縮功能［9］。本研究通過一次性腹腔注射四氧嘧啶破壞小鼠胰島構(gòu)建糖尿病模型，ICA 灌胃給藥2 周后小鼠多飲、多食、體重下降等癥狀較模型組有所改善。給藥結(jié)束后取各組小鼠的胸主動(dòng)脈，通過離體血管灌流的方法檢測(cè)ICA對(duì)糖尿病小鼠血管環(huán)舒縮功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈由Phe、KCl 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)和由Ach 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張均受到明顯損傷，而ICA 給藥顯著改善糖尿病小鼠Phe 誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)和由Ach 誘導(dǎo)的血管環(huán)舒張反應(yīng)，對(duì)KCl誘導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)有一定改善作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常組相比，模型組對(duì)SNP 誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張基本無變化，表明糖尿病早期，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙，平滑肌細(xì)胞受損程度較弱。

eNOS 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)產(chǎn)生NO，擴(kuò)散至下層血管平滑肌細(xì)胞引起松弛效應(yīng)［16］。eNOS失調(diào)導(dǎo)致的NO 生物利用度降低是導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙的主要特征［17］。p38 MAPK是MAPK 家族的關(guān)鍵成員，是炎癥和氧化應(yīng)激的重要參與者，在心血管疾病中起著重要作用［18］，也參與內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展［19］。p38 MAPK 的激活會(huì)加速炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙［20］。本研究通過體外高糖誘導(dǎo)HUVECs構(gòu)建細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)高糖導(dǎo)致HUVECs 細(xì)胞中eNOS 的活化降低、p38 MAPK 磷酸化水平升高，ICA（30 μmol/L）可以逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的變化，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。說明ICA 可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/eNOS信號(hào)通路改善內(nèi)皮功能障礙。

綜上所述，ICA 可能通過抑制p-p38 MAPK 表達(dá)，提高內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS 的磷酸化水平，進(jìn)而改善糖尿病狀態(tài)下小鼠胸主動(dòng)脈的血管舒縮功能，ICA有望成為治療糖尿病血管病變的潛在藥物。