馮梓琦 巫瑤 于洋 朱玲 萬(wàn)莉紅△

（1.明遠(yuǎn)學(xué)園——基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)拔尖學(xué)生培養(yǎng)基地（懷德班）2019 級(jí)，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610041）

膿毒癥相關(guān)性腦?。⊿epsis-associated encephalopathy，SAE）是膿毒癥累及大腦而引起的彌漫性腦功能障礙，臨床上主要表現(xiàn)為躁動(dòng)、注意力下降、意識(shí)改變、睡眠節(jié)律紊亂、譫妄[1]。研究表明SAE 與膿毒癥患者預(yù)后相關(guān)，可導(dǎo)致患者長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙[2]。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是導(dǎo)致膿毒癥腦病的直接因素[3]。

壞死性凋亡的概念在2005 年被首次提出，被證實(shí)在精密調(diào)控下參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境中異常激活的神經(jīng)細(xì)胞壞死性凋亡（Necroptosis）與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如：多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥[5]。尤其在神經(jīng)炎癥時(shí)，LPS 通過(guò)直接結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞上的Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）使小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎M1 樣極化狀態(tài)激活，產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性因子和神經(jīng)免疫炎癥因子作用于神經(jīng)元細(xì)胞[6]，在Caspase-8 活性被抑制時(shí)，受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）與受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（Receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）作用，將混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（Mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）磷酸化激活，使其移位至細(xì)胞膜處并破壞膜的完整性[7]。

丹參酮ⅡA 是從中藥丹參中提取出的脂溶性有效成分，臨床主要用于治療心血管疾病。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮 ⅡA 對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，可明顯改善AD 小鼠的認(rèn)知功能[8]。但目前尚無(wú)研究證實(shí)丹參酮 ⅡA 對(duì)SAE 神經(jīng)元的保護(hù)作用，因此本文擬LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的共培養(yǎng)系統(tǒng)，探究丹參酮 ⅡA 對(duì)神經(jīng)元活性以及壞死性凋亡通路蛋白MLKL 表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

DMEM（Cytiva，美國(guó)），胎牛血清（FBS，gibco，美國(guó)），青霉素/鏈霉素（普諾賽，中國(guó)武漢），RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)北京），CCK8 Assay Kit（PAE×BIO，美國(guó)）BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore,Billerica,MA,USA），抗MLKL 單克隆抗體（1 :1000，Cell Signaling Technology，USA），小鼠單克隆抗β-actin 抗體（1:1000，Cell Signaling Technology，USA）。

1.1.2 細(xì)胞

小鼠永生化小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（中國(guó)，武漢），人髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHSY-5Y 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（中國(guó)，武漢）。

1.2 方法

1.2.1 條件培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的共培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建

BV-2 細(xì)胞采用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）常規(guī)培養(yǎng)后，以每孔104接種于96 孔板，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度LPS（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1）刺激24 h。取BV-2 培養(yǎng)上清液與DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）按照體積比1:1 混合，建立共培養(yǎng)系統(tǒng)用于培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞。

1.2.2 CCK8 法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

以上述共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞24 h后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)3h 后，用酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國(guó)）測(cè)定各組樣品在450 nm 處的吸光度值。

1.2.3 丹參酮IIA 對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活性的影響

（1）常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y 后以不同濃度丹參酮IIA（0、0.1、1、5、10、20、40、80、160 μM）刺激24 h，采用1.2.2 中方法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，計(jì)算丹參酮IIA 的IC50。

（2）常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y，以不同濃度丹參酮IIA（0、0.2、1 μM）預(yù)處理4 h 后，以上述共培養(yǎng)系統(tǒng)繼續(xù)培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞24 h，采用1.2.2中方法測(cè)定細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting

收集SH-SY5Y 細(xì)胞以RIPA 裂解液裂解后在4℃下以12000 rpm 離心10 min 后取上清，稀釋10 倍后用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取蛋白質(zhì)40 μL 在10%SDS-PAGE 中進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫下用5%脫脂牛奶孵化2 h 后以含0.1% Tween 20 的Tris 緩沖鹽水（Tris Buffered Saline with Tween 20，TBST）洗滌三次，每次10 min，然后將PVDF 膜在小鼠抗MLKL 單克隆抗體和小鼠單克隆抗β-actin 抗體中連續(xù)孵育3 h。經(jīng)TBST 洗膜三次后在室溫下加入二抗孵育2 h。使用Western Lightning TM Chemiluminescence Reagent Plus 檢測(cè)所有蛋白質(zhì)，并使用ImagJ掃描灰度值對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用oneway ANOVA 方差分析檢驗(yàn)，其中P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)系統(tǒng)條件優(yōu)化

不同濃度梯度LPS（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μg·mL-1）刺激BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞后收集上清作為條件培養(yǎng)液，與DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）按照體積比1:1 混合建立的共培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響呈現(xiàn)劑量依賴性，即隨LPS 濃度遞增SH-SY5Y 細(xì)胞活性逐漸下降，見圖1；LPS的IC50為0.27 μg·mL-1，故確定0.2 μg·mL-1作為后續(xù)試驗(yàn)所需LPS 濃度。

圖1 CCK8 法檢測(cè)SH-SY5Y 細(xì)胞活性

2.2 LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建條件培養(yǎng)系統(tǒng)可誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死性凋亡

LPS 刺激BV-2 構(gòu)建條件培養(yǎng)系統(tǒng)可顯著增加SH-SY5Y 細(xì)胞MLKL 蛋白表達(dá)水平（P<0.05），見圖2；說(shuō)明條件共培養(yǎng)系統(tǒng)中SH-SY5Y 神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

圖2 LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建條件培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞MLKL 表達(dá)水平的影響

2.3 丹參酮ⅡA 對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

如圖3-A 所示，隨著丹參酮ⅡA 給藥劑量的增加，SH-SY5Y 細(xì)胞活性逐漸下降，其 IC50為7.94 μM，因此丹參酮ⅡA后續(xù)給藥劑量選擇0.2、1 μM。如圖3-B 所示，丹參酮ⅡA 可明顯增加共培養(yǎng)體系中SH-SY5Y 神經(jīng)元細(xì)胞活性。光鏡可見條件培養(yǎng)基刺激使神經(jīng)元數(shù)量減少、突起變短甚至消失（圖4-B），而丹參酮ⅡA 預(yù)保護(hù)后神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量改變均減輕（圖4-C，D）。經(jīng)WB 測(cè)定發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 可明顯降低LPS 刺激BV-2構(gòu)建條件培養(yǎng)系統(tǒng)引起的MLKL 上調(diào)（P<0.05），見圖5。

圖3 CCK8 法測(cè)定丹參酮IIA 對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞活性的影響

圖4 不同濃度丹參酮IIA 對(duì)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響（×20）

圖5 不同濃度丹參酮IIA 對(duì)神經(jīng)元MLKL 水平的影響

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。在致炎因子作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，呈現(xiàn)促炎表型M1 樣和抗炎表型M2 樣兩種極化狀態(tài)。脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可直接結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR-4 使其處于促炎的M1 樣極化狀態(tài)[9]，通過(guò)激活NF-κB 通路，釋放各種炎癥因子，從而對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷[6]。在本研究中，先用LPS 對(duì)BV-2 進(jìn)行24 h 刺激模擬體內(nèi)內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細(xì)胞，取其含多種炎癥因子的上清液培養(yǎng)SH-SY5Y，排除了神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞接觸及其他復(fù)雜環(huán)境作用的影響，針對(duì)性地模擬了SAE 中小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥環(huán)境所造成的神經(jīng)元損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 間接刺激神經(jīng)元使其增殖能力降低，形態(tài)發(fā)生異常改變、細(xì)胞數(shù)量減少。

神經(jīng)元的壞死性凋亡通路在多種炎性因子作用下被激活，上調(diào)MLKL 激活后破壞膜完整性，形態(tài)異常具有壞死和凋亡的混合特征。壞死性凋亡已被證實(shí)在SAE 大鼠模型中參與神經(jīng)元損傷過(guò)程，引起中樞功能異常[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建以條件培養(yǎng)為基礎(chǔ)的共培養(yǎng)體系，在體外驗(yàn)證了內(nèi)毒素刺激BV-2 產(chǎn)生的含炎癥因子的上清能夠上調(diào)SH-SY5Y 中的MLKL，鏡下神經(jīng)元間聯(lián)系及樹突軸突減少，胞體由圓形多邊形縮小成異常梭形，核凝集固縮，發(fā)生壞死性凋亡。說(shuō)明在SAE中小膠質(zhì)細(xì)胞激活后介導(dǎo)的炎癥環(huán)境即可通過(guò)誘導(dǎo)壞死性凋亡造成神經(jīng)元損傷，引起中樞功能異常。

丹參藥用歷史悠久，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛、清心除煩等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明其有保護(hù)心血管、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性。丹參酮ⅡA 是從中藥丹參中提取出的脂溶性有效成分，屬于菲醌類化合物衍生物，臨床主要用于治療心血管疾病。本研究結(jié)果顯示，在基于LPS 刺激BV-2 的條件共培養(yǎng)環(huán)境中，丹參酮ⅡA 可以減輕SHSY5Y 的形態(tài)異常及數(shù)量減少，能夠下調(diào)炎癥刺激引起的MLKL 高表達(dá)，抑制神經(jīng)元發(fā)生壞死性凋亡，緩解小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中神經(jīng)元的損傷。

在本文中，我們通過(guò)體外構(gòu)建條件共培養(yǎng)體系，模擬膿毒癥相關(guān)性腦病中內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 可以保護(hù)神經(jīng)元免受壞死性凋亡造成的損傷，表明中藥丹參對(duì)治療膿毒癥腦病具有較強(qiáng)的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。