岑建芳，王慧曉，周志強，楊立云

(南寧師范大學(xué) 廣西天然高分子化學(xué)與物理重點實驗室，廣西 南寧 530001)

0 引言

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人血清中含量最豐富的載體蛋白質(zhì)[1]，占人體血漿總蛋白的50%～60%，其在維持滲透壓的平衡和轉(zhuǎn)運藥物小分子中扮演著重要的角色。當(dāng)不同結(jié)構(gòu)的藥物分子進入人體后，血清蛋白會和這些物質(zhì)發(fā)生相互作用[1-3]，進而影響藥物的釋放和代謝。因此，研究人血清白蛋白與藥物分子的相互作用，對了解藥物在人體內(nèi)的吸收、運輸、儲存及代謝進程，具有重要意義。

氯喹(Chloroquine,CQ)是一種應(yīng)用廣泛的自噬抑制劑，能抑制溶酶體的活性，進而破壞自噬體與溶酶體的融合，因此對多種癌細胞具有較好的抑制效果。將CQ與化療、光熱治療等方法相結(jié)合，可明顯提高抗腫瘤效果。例如，Chen等[4]通過聯(lián)合紫檀芪和氯喹來治療胰腺導(dǎo)管腺癌；Xu等[5]設(shè)計了一個功能化的二硫化鉬納米片遞送阿霉素和氯喹，可有效地殺死Hela-R細胞。最新的研究結(jié)果表明CQ有望用于新型冠狀病毒的治療[6]。

通過模擬人體生理環(huán)境，采用熒光光譜、圓二色光譜等方法，在分子水平探討了CQ和HSA的作用機制，獲取此過程中的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合模式，同時探究了CQ對HSA蛋白結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果有望為CQ的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計(英國Perkin Elmer公司)；QM-8075型高靈敏度穩(wěn)瞬態(tài)熒光光譜儀 (日本HORIBA公司)；圓二色光譜儀(英國Applied Photophysics)；人血清白蛋白(>96%，美國Sigma-aldrich公司)；氯喹(>98%，美國Sigma-aldrich公司)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉(AR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜

熒光猝滅光譜：在pH =7.4的PBS溶液中，利用LS-55熒光分光光度計測量不同溫度 (298K，304K，310 K)下，CQ與HSA相互作用的熒光光譜。其中，C(HSA)= 2.0×10-6mol/L，C(CQ)= 9.693×10-4mol/L，CQ以3 μL的體積累計加入HSA溶液。激發(fā)波長設(shè)為280 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為：15 nm和10 nm，記錄波長范圍:280 ～480 nm。

同步熒光光譜：在298 K時，設(shè)置儀器激發(fā)波長和發(fā)射波長的波長差(Δλ)分別為15 nm和60 nm，分別得到酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征譜圖。

1.2.2 熒光壽命

激發(fā)波長設(shè)為278 nm、發(fā)射波長設(shè)為350 nm、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設(shè)為15 nm和10 nm，用QM-8075型高靈敏度穩(wěn)瞬態(tài)熒光光譜儀測量HSA及HSA-CQ體系的熒光壽命。

1.2.3 圓二色光譜

常溫下，掃描范圍為200～260 nm，響應(yīng)時間為0.5 s，儀器由Chirascan控制。HSA和CQ的摩爾比為:1∶0,1∶4,1∶10,1∶20,1∶40，平行測定3次。利用SELCON3軟件計算HSA中各二級結(jié)構(gòu)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機制和結(jié)合常數(shù)

HSA在350 nm附近呈現(xiàn)較強的熒光發(fā)射峰，而CQ幾乎不具有內(nèi)源熒光(曲線I表示)。隨著CQ的不斷加入，HSA的熒光強度逐漸減小，且最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)明顯紅移，表明CQ能有效猝滅HSA的內(nèi)源熒光。不同濃度的CQ與HSA相互作用時，HSA的熒光光譜圖(T= 298 K,C(HSA)= 2.0×10-6mol/L,C(CQ)/(×10-4mol/L),A～H: 0, 0.06,0.11,0.17,0.23,0.29,0.35,0.41),CQ猝滅HSA的熒光光譜(圖1)。

圖1 HSA的熒光光譜:曲線I:CQ的熒光光譜圖

熒光猝滅類型分為2種：動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。對動態(tài)猝滅，猝滅劑與熒光體分子之間發(fā)生有效碰撞，不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和生理活性發(fā)生變化，因此其猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度上升而增大；靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅不同，因其生成了靜態(tài)復(fù)合物，因此猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度上升而減小[7，8]。這種猝滅類型不僅在微觀方面影響蛋白質(zhì)的二級構(gòu)象，且在宏觀層面上也會影響蛋白質(zhì)的生理活性。為了研究CQ猝滅HSA的作用機制，用Stern-Volmer方程處理不同溫度下(298、304和310 K)的熒光猝滅數(shù)據(jù)：

F0/F=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0為HSA單獨存在時的熒光強度；F為加入CQ后HSA的熒光強度。[Q]為CQ的濃度，Ksv為猝滅常數(shù)。以F0/F對[Q]作圖，擬合得直線，如圖2所示，計算Ksv的結(jié)果(表1)。顯然，隨著溫度上升，熒光猝滅常數(shù)Ksv減小，說明CQ與HSA的作用模式是靜態(tài)猝滅。

圖2 三個不同溫度下時的Stern-Volmer關(guān)系圖

表1 CQ和HSA相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)以及熱力學(xué)常數(shù)

為了進一步驗證CQ與HSA作用是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，利用時間分辨熒光光譜法測定CQ作用前后HSA的熒光壽命。動態(tài)猝滅會使HSA的熒光壽命改變，而靜態(tài)猝滅的熒光壽命則基本保持不變[9,10],如圖3所示。HSA的熒光壽命是6.03±0.05 ns，HSA-CQ體系的熒光壽命為5.87±0.10 ns?？梢姡珻Q加入HSA前后，HSA的熒光壽命并沒有很明顯的改變，進一步證明了CQ和HSA之間是有靜態(tài)復(fù)合物生成的靜態(tài)猝滅。

對靜態(tài)猝滅，猝滅數(shù)據(jù)可以用修正的Stern-Volmer方程來進一步處理[11,12],修正方程為：

F0/ΔF=1/(Kafa[Q])+1/fa

(2)

式中： ΔF為CQ作用前后HSA的熒光強度的差值(F0-F)，fa為熒光團可接近猝滅劑的部分，Ka為CQ與HSA相互作用體系中的有效猝滅常數(shù)，其值與結(jié)合常數(shù)接近。以F0/ΔF對1/[Q]作圖，如圖4所示，所得熱力學(xué)參數(shù)見表1。由表1知，結(jié)合常數(shù)Ka隨著溫度的升高而減小，與Ksv隨溫度的變化趨勢一致，說明CQ確實與HSA結(jié)合生成靜態(tài)復(fù)合物。

圖4 不同溫度下修正的Stern-Volmer關(guān)系圖

2.2 CQ和HSA之間的結(jié)合模式

一般情況下，小分子與生物大分子之間主要通過疏水作用力、靜電引力、氫鍵和范德華力等發(fā)生相互作用[13]。為了判斷CQ與HSA之間的主要作用力類型，可以通過Van’t Hoff方程計算二者之間相互作用過程中的焓變(ΔH)、熵變(ΔS)：

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

式中：Ka為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為標準氣體常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度。以lnKa對1/T作圖，如圖5所示。由斜率可求出焓變(ΔH)，由截距可以求出熵變(ΔS)，反應(yīng)的吉布斯自由能(ΔG)可由式(4)計算。

圖5 CQ與HSA相互作用的Van’t Hoff曲線

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

熱力學(xué)參數(shù)列于表1?？梢?，CQ與HSA相互作用的吉布斯自由能變ΔG<0，表明CQ與HSA相互作用是自發(fā)反應(yīng)；ΔH<0，說明兩者之間的反應(yīng)為放熱反應(yīng)；ΔH<0、ΔS<0，說明兩者之間的結(jié)合力主要是氫鍵和范德華力[14,15]。

2.3 CQ對HSA二級結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 同步熒光光譜

CQ與HSA作用前后的同步熒光光譜圖(圖6)。當(dāng)Δλ = 15 nm時，提供酪氨酸殘基特征譜圖，當(dāng)Δλ=60 nm時，提供色氨酸殘基特征譜圖[16]。從圖6a可知，隨著CQ不斷加入，酪氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長基本保持不變，說明酪氨酸殘基周圍環(huán)境沒有變化。而色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象，說明色氨酸殘基周圍環(huán)境的親水性增大(圖6b)[17]。不同濃度的CQ與HSA相互作用時，HSA的同步熒光光譜圖(圖T= 298 K,C(HSA)= 2.0×10-6mol/L,C(CQ)/ (×10-4mol/L),A～H: 0,0.06,0.11,0.17,0.23,0.29,0.35,0.41)，如圖6所示。

圖6 不同濃度的CQ與HSA相互作用時，HSA的同步熒光光譜圖

2.3.2 圓二色光譜

圓二色光譜可以反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化。如圖7所示，HSA的CD光譜有兩個負的吸收峰，分別在208 nm和222 nm。在208 nm處的吸收峰反映了HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收[18，19]。從圖7中可以看出，隨著CQ濃度的增加，兩個吸收峰的強度都有所降低，且208 nm處的吸收峰降低更為顯著。

圖7 pH=7.4時的HSA-CQ體系的CD光譜圖

為了定量分析HSA二級結(jié)構(gòu)的改變，使用SELCON3解析CD數(shù)據(jù)，結(jié)果列于表2，可以看出α-螺旋含量由原來的62.6%下降到44.6%，說明HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)有所伸展，原因是CQ與蛋白質(zhì)的多肽鏈的氨基酸殘基結(jié)合，破壞了蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肽鏈變得疏松[20]。

表2 SELCON3 解析得到不同二級結(jié)構(gòu)的分數(shù)

3 結(jié)論

綜合利用熒光光譜、圓二色光譜等方法，探究了CQ和HSA的相互作用。結(jié)果表明，CQ能通過靜態(tài)猝滅的模式有效猝滅HSA的內(nèi)源熒光，且結(jié)合常數(shù)Ka隨著溫度T的上升而減小，與熒光猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的變化趨勢一致。通過作用過程中的熱力學(xué)參數(shù)，可以得到兩者的主要結(jié)合力為氫鍵和范德華力，且為自發(fā)反應(yīng)。同步熒光光譜結(jié)果表明，CQ與HSA相互作用后，蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基周圍環(huán)境不變，色氨酸殘基周圍環(huán)境的親水性增大。圓二色光譜表明，CQ與HSA的相互作用改變了HSA的二級結(jié)構(gòu)。