袁博 陳洋 袁競(jìng)妍 曾麗忠 楊拴盈

在全人類中，肺癌仍然是造成癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計(jì)，2020年估計(jì)有180萬人（18%）死于肺癌。在所有的肺癌病例中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的比例超過80%。目前最常見的NSCLC亞型包括肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC），分別約占所有NSCLC病例的40%和25%-30%[2]。LUSC患者的總生存期（overall survival,OS）常較其他的NSCLC亞型患者短，一方面是由于確診時(shí)患者年齡大、分期晚且常伴有轉(zhuǎn)移[3,4]；另一方面，與LUAD治療時(shí)可選擇的眾多小分子靶向藥物相比，目前針對(duì)LUSC的治療方法很有限，仍以化療為主[5]。LUSC每年造成的死亡人數(shù)超過40萬，使其成為制約NSCLC 5年生存率的重要影響因素[6]。因此，深入探明調(diào)控LUSC增殖或轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制并進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，對(duì)改善患者預(yù)后十分重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNAs）是最常見的不具有編碼蛋白質(zhì)功能的一類RNA，其序列長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸[7]。隨著對(duì)LncRNAs生物學(xué)功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其可以通過表觀修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等多種途徑參與基因的調(diào)控[8]。LncRNAs的異常表達(dá)可引起多種人類疾病，特別是腫瘤性疾病[9]。據(jù)報(bào)道，LncRNAs可作為促癌或者抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。異常表達(dá)的LncRNAs可參與包括細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成等多種生物學(xué)過程[11,12]。鑒于此，LncRNAs很有可能成為腫瘤診斷的分子指標(biāo)或治療靶點(diǎn)，為人類腫瘤的研究提供新的方向。

LncRNA 00668（LINC00668）是一條長(zhǎng)度為1,751 bp的非編碼RNA，定位于染色體18p11.31。LINC00668的研究在一些腫瘤中已取得初步進(jìn)展，包括通過影響細(xì)胞周期或抑制凋亡促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞或結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移[13-16]。An等[17]報(bào)道稱LINC00668在NSCLC中的表達(dá)量升高，且影響LUAD細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲；然而，LUAD和LUSC除在病理學(xué)形態(tài)分化方面不同外，兩種亞型在基因的表達(dá)、突變頻譜、驅(qū)動(dòng)基因等各方面也存在明顯的差異，因此，有必要在LUAD和LUSC兩種NSCLC亞型中分別研究LINC00668的預(yù)后價(jià)值及生物學(xué)功能[18]。

在本項(xiàng)研究中，我們利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Altas, TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分別分析了LINC00668在LUAD和LUSC中的表達(dá)情況及其與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，并通過在體外肺鱗癌細(xì)胞系中敲低LINC00668探索其在細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) 535例LUAD及59例正常組織和502例LUSC及49例正常組織的轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序信息及相應(yīng)的500例LUAD患者和490例LUSC患者的臨床資料下載自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://gdc-portal.nci.nih.gov/）。臨床資料包括性別、年齡、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis, TNM）分期、吸煙情況、生存期和生存狀態(tài)并總結(jié)于表1中。Kaplan-MeierPlotter（Kmplot）網(wǎng)站（https://kmplot.com/analysis/）可以評(píng)估包括肺癌在內(nèi)的21種癌癥類型中54,000種基因（mRNA, miRNA,LincRNA）對(duì)生存率的影響。

表1 腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌和肺鱗癌患者的臨床信息Tab 1 Clinical information of LUAD and LUSC patients in TCGA database

1.2 組織收集 我們從2018年3月-2019年3月連續(xù)收集了就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院的10例LUSC患者的腫瘤及其癌旁組織。這10例患者中有8例男性。我們的研究方案已獲得西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。10例患者均提供了書面知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和肺鱗癌細(xì)胞系H2170、H226、H520以及人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所（上海，中國(guó)）。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%的青霉素及鏈霉素的RPMI-1640（Gibco，美國(guó)）的培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞在37oC恒溫、5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期鋪于6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LINC00668的“短發(fā)夾”RNA（short hairpin RNA, shRNA）由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)構(gòu)建，用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，用嘌呤霉素篩選2代-3代，隨后在顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光攜帶情況初步判斷轉(zhuǎn)染效率。shRNA的序列見表2。

表2 “短發(fā)夾”RNA序列Tab 2 Short hairpin RNA (shRNA) sequence

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 組織RNA和細(xì)胞RNA分別用Fast1000和Fast200提取?？俁NA用PrimerScrip? RT試劑盒（TAKARA, BIO INC）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按照制造商說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。LINC00668及GAPDH的引物序列如表3所示?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用2-ΔΔCq表示[19]。

表3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列Tab 3 Primer sequence of qRT-PCR

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞并接種到96孔板中，每孔約100 μL、3×103個(gè)細(xì)胞。分別在鋪板后24 h、48 h、72 h于每孔加入培養(yǎng)基總體積10%的CCK-8溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即每孔加入10 μL的CCK-8溶液。加入工作液后將96孔培養(yǎng)板重新放置于37oC、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)約40 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)96孔培養(yǎng)板各孔的吸光值即OD值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞培養(yǎng)至100%融合后，用10 μL移液管尖劃痕。然后用低血清培養(yǎng)基（1%胎牛血清）代替完全培養(yǎng)基。在0 h、24 h和48 h分別對(duì)刮拭區(qū)域拍攝圖像。使用Image J軟件（version 1.52）計(jì)算創(chuàng)面面積。

1.7 Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，計(jì)數(shù)。將4×104個(gè)H2170細(xì)胞以200 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)基接種于上室，然后在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色。將小室上面細(xì)胞清除，顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下面的細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析在SPSS 19.0中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。計(jì)數(shù)資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法估算OS，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00668在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)量升高 我們首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中535例LUAD及59例正常組織和502例LUSC及49例正常組織中LINC00668的表達(dá)量，結(jié)果顯示其在LUAD及LUSC組織中的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）（圖1A，圖1B）。

隨后我們分別在LUSC及LUAD中進(jìn)一步分析了LINC00668的表達(dá)量與TNM分期的關(guān)系。結(jié)果顯示，在LUSC中，LINC00668的表達(dá)量和腫瘤分期密切相關(guān)，相較于早期（I期），其表達(dá)量在中晚期（II期-IV期）LUSC中明顯升高（1.77±0.13vs2.16±0.15,P＜0.05）（圖1C）；同時(shí)，相較于T1-T2，LINC00668在T分期晚期（T3-T4）的LUSC中表達(dá)量也顯著升高（1.88±0.10vs2.38±0.28,P＜0.05）（圖1D）。雖然其表達(dá)量在N分期的早期及中晚期的LUSC中無明顯差異，但是有明顯趨勢(shì)顯示其在N分期中晚期（N1-N3）時(shí)表達(dá)量增高（1.85±0.12vs2.23±0.18,P=0.07）（圖1E）。在LUAD中，LINC00668的表達(dá)量與腫瘤的TNM分期無明顯關(guān)系（圖1F-圖1H）。

接下來，我們又以中位表達(dá)量為界將LUSC患者分為L(zhǎng)INC00668高表達(dá)或低表達(dá)組，分別探索其與患者年齡、性別、TNM分期及吸煙情況的關(guān)系，結(jié)果顯示，LINC00668高表達(dá)傾向于男性、晚期及吸煙患者（表4）。

表4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LINC00668表達(dá)量高低兩組的LUSC患者臨床特征[n(%)]Tab 4 Clinical characteristics of LUSC patients with high or low LINC00668 expression level in TCGA database [n(%)]

2.2 LINC00668與吸煙密切相關(guān)且影響LUSC吸煙患者的預(yù)后 我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中OS數(shù)據(jù)進(jìn)一步探索了LINC00668的表達(dá)和生存的關(guān)系，結(jié)果顯示，無論在LUSC或LUAD中，LINC00668的表達(dá)量與患者的OS無明顯相關(guān)（P＞0.05）（圖2A，圖2B）。

吸煙是肺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且參與并促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展。接下來，我們進(jìn)一步探索了LINC00668的表達(dá)量和吸煙情況的關(guān)系。結(jié)果顯示，無論在LUSC或LUAD中，LINC00668在吸煙患者中的表達(dá)量均明顯升高（LUSC: 1.84±0.12vs2.46±0.23; LUAD: 0.16±0.02vs0.29±0.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2C，圖2D）。

Kaplan-MeierPlotter（Kmplot）網(wǎng)站囊括了CaBIG（http://cabig.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中肺癌的數(shù)據(jù)，可以擴(kuò)大樣本量更好地分析基因與生存的關(guān)系。有趣的是，在LUSC中，LINC00668的表達(dá)量仍然與患者的OS無明顯相關(guān)（P＞0.05）（圖2E）；然而，LINC00668的表達(dá)量卻與吸煙LUSC患者的OS顯著相關(guān)，LINC00668高表達(dá)的吸煙肺鱗癌患者的生存期明顯低于低表達(dá)的吸煙患者[HR: 2.74 (1.09-6.85),P＜0.05]（圖2F）。

LINC00668的表達(dá)量與LUSC患者的臨床分期相關(guān)；吸煙是LUSC的高危因素之一，LINC00668表達(dá)量在吸煙患者中顯著升高，且與吸煙LUSC患者的OS顯著相關(guān)。以上結(jié)果提示，與LUAD相比，LINC00668與LUSC關(guān)系更加密切。

2.3 LINC00668在LUSC細(xì)胞系及組織中表達(dá)量升高 為了驗(yàn)證我們的猜想，我們檢測(cè)了LINC00668在正常支氣管上皮及多種LUAD或LUSC細(xì)胞系中的表達(dá)量。相較于正常支氣管上皮細(xì)胞HBE，LINC00668在三株LUSC細(xì)胞系H2170、H226、H520中表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但是，其在LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299中的表達(dá)量無顯著升高（P＞0.05）（圖3A）。

qRT-PCR結(jié)果顯示LINC00668在腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。

2.4 敲低LINC00668不影響肺鱗癌細(xì)胞的增殖，但抑制其轉(zhuǎn)移侵襲 我們選擇LINC00668表達(dá)量最高的LUSC細(xì)胞系H2170進(jìn)行下一步功能實(shí)驗(yàn)的探索。轉(zhuǎn)染后熒光鏡下圖片顯示轉(zhuǎn)染效率＞70%（圖4A）。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒shRNA1和shRNA2的H2170細(xì)胞表達(dá)LINC00668的量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4B）。因此，在H2170細(xì)胞系中成功構(gòu)建了有效的LINC00668敲低模型。

為了探索LINC00668在H2170細(xì)胞增殖中的作用，我們進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)，分別在鋪板后24 h、48 h及72 h檢測(cè)了三組細(xì)胞的吸光度值，結(jié)果顯示，三組并無明顯差異（圖4C）。以上結(jié)果提示，在H2170細(xì)胞中敲低LINC00668并不影響細(xì)胞的增殖。

為了探索LINC00668對(duì)H2170細(xì)胞遷移侵襲的影響，我們首先進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，劃痕后24 h和48 h，LINC00668敲低組shRNA1和shRNA2的劃痕區(qū)域面積明顯大于對(duì)照組（P＜0.05）（圖4D，圖4E）。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，LINC00668敲低組shRNA1和shRNA2穿到小室下面的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（210±6vs92±6vs108±7,P＜0.05）（圖4F，圖4G）。以上結(jié)果提示，敲低LINC00668顯著抑制了H2170肺鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3 討論

肺癌仍是人類最常見的惡性腫瘤之一和主要的公共衛(wèi)生問題。因此，發(fā)現(xiàn)新的分子診斷指標(biāo)和特異性的治療靶點(diǎn)十分關(guān)鍵。近年來，隨著對(duì)LncRNAs的生物學(xué)功能及作用機(jī)制的深入研究，越來越多的證據(jù)指出其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種LncRNAs參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等復(fù)雜的生物學(xué)過程[20]。在本研究中，通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA的分析，結(jié)合體外的生物學(xué)功能試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)LINC00668是一個(gè)與吸煙相關(guān)且影響LUSC細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的特異性LncRNA，可以通過抑制LINC00668減少LUSC的轉(zhuǎn)移。

NSCLC是一種異質(zhì)性疾病，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)分類，可分為L(zhǎng)UAD和LUSC兩大亞類。隨著二代測(cè)序（second-generation sequencing, NGS）技術(shù)的進(jìn)步和肺癌精準(zhǔn)治療的發(fā)展，LUAD和LUSC在基因組層面的差異逐漸明了，兩者有著明顯不同的突變模式[21-23]。例如，已成功研發(fā)出有效的靶向藥物的表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）和c-ros肉瘤致癌因子受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase,ROS1）等驅(qū)動(dòng)突變常發(fā)生在LUAD中，而這些驅(qū)動(dòng)突變?cè)贚USC中的發(fā)生率則較低[24,25]，提示相同的分子在LUAD或LUSC中可能扮演著不同的角色。以往的研究[17]顯示，LINC00668在NSCLC中表達(dá)量增高，在TNM分期晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)量較高，同時(shí)其表達(dá)量增高與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。但是該研究并沒有分別探索LINC00668的表達(dá)量與LUAD或LUSC兩種肺癌亞型患者的臨床特征的關(guān)系。有趣的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)，LINC00668雖然在LUAD和LUSC中的表達(dá)量均明顯升高，但與LUAD不同的是，在LUSC中，其表達(dá)量和患者的TNM分期密切相關(guān)。更值得一提的是，該LncRNA與吸煙關(guān)系密切，吸煙又是肺鱗癌的重要特征之一[26]，同時(shí)它還是吸煙LUSC患者的預(yù)后指標(biāo)，這些特點(diǎn)都指出LINC00668可能是參與LUSC發(fā)生發(fā)展的特異性LncRNA。以前也有報(bào)道指出LINC00668參與鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移。Zhang等[27]報(bào)道LINC00668在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)量顯著升高；同時(shí)，其通過和miR-297相互作用促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞的增殖。Zhao等[28]通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中喉鱗狀細(xì)胞癌的芯片分析，發(fā)現(xiàn)LINC00668在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)量顯著升高，且與患者的臨床分期、病理分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)敲低LINC00668可有效抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

肺癌在最初診斷時(shí)常伴隨侵襲和轉(zhuǎn)移，是造成肺癌死亡的主要原因[29]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌細(xì)胞系H2170中敲低LINC00668并不影響細(xì)胞增殖，但是明顯抑制了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在另一項(xiàng)關(guān)于NSCLC的研究[17]中，研究者發(fā)現(xiàn)敲低LINC00668可以促進(jìn)LUAD細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299的凋亡從而抑制細(xì)胞增殖。LINC00668在不同腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能有所不同。在乳腺癌中，敲低LINC00668可有效促進(jìn)凋亡并抑制細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]；同時(shí)，另有一篇文獻(xiàn)[14]報(bào)道其通過調(diào)節(jié)SND1影響乳腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞性和侵襲轉(zhuǎn)移。在胃癌和肝癌中，LINC00668通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15,30]。在結(jié)腸癌中，LINC00668通過和miR-188-5p相互作用調(diào)節(jié)USP47促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

當(dāng)然，本研究也有很多不足之處。第一，我們僅在10對(duì)LUSC組織及其配對(duì)的癌旁組織中檢測(cè)了LINC00668的表達(dá)量，后續(xù)可以增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證并探討LINC00668表達(dá)量和患者臨床特征的關(guān)系；第二，本研究的體外實(shí)驗(yàn)只運(yùn)用了一種細(xì)胞系，可增加細(xì)胞系種類進(jìn)一步驗(yàn)證LINC0068在LUSC中的生物學(xué)功能；第三，我們并沒有深入探究LINC00668影響LUSC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，這也是接下來我們的重點(diǎn)工作內(nèi)容。

綜上所述，我們的研究初步證明了LINC00668在LUSC中高表達(dá)，與LUSC患者的腫瘤TNM分期密切相關(guān)，同時(shí)它還是吸煙LUSC患者的預(yù)后指標(biāo)。體外細(xì)胞中敲低LINC00668可有效降低LUSC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。以上結(jié)果提示LINC00668可能與LUSC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過抑制LINC00668可以在一定程度上減少LUSC的轉(zhuǎn)移。

Author contributions

Yang SY conceived the project and supervised the experiments. Yuan B, Chen Y and Yuan JY conducted the experiments. Yuan B and Zeng LZ performed the data analysis.Yuan B drafted the manuscript. Chen Y, Yuan JY, Zeng LZ and Yang SY revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.