韓佳月，項建軍，金華

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230000 2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230000

膜性腎?。∕embranous nephropathy，MN）是一組由免疫復(fù)合物介導(dǎo)的足細胞病變，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿，為腎病綜合征最常見的病理類型之一[1]。MN傳統(tǒng)治療為激素聯(lián)合免疫抑制劑，但部分患者出現(xiàn)感染、股骨頭壞死等副作用[2]，且病情易反復(fù)，最終進展至終末期腎?。‥SRD），對患者生活質(zhì)量造成嚴重影響。近年來發(fā)現(xiàn)[3-4]，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是足細胞損傷的重要因素，而自噬對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的足細胞損傷具有保護作用，該機制有望成為防治足細胞病變的重要途徑。大鼠尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）是制作MN的經(jīng)典模型。中醫(yī)藥治療MN體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，既往研究證實參地顆粒在治療腎小球疾病中已取得顯著療效[5-6]。本研究將進一步觀察參地顆粒對C-BSA大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及足細胞損傷的干預(yù)作用，從而探討其治療MN的作用機理。

材料與方法

1 實驗動物

2月齡清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（合格證號：SCXK（魯）2019-0003），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 實驗藥物與試劑

參地顆粒（人參、熟地黃、茯苓、五味子、桑螵蛸、雞內(nèi)金、川芎），由安徽省中醫(yī)院制劑中心研制（皖藥制字BZ20080025），每袋顆粒劑10g，含生藥劑量 34 g。纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司），國藥準字：H20040217，每片80mg。陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）購自北京索萊寶科技有限公司（批號：725M036）。弗氏不完全佐劑（F5506）購自Sigma公司（批號SLBL9742V）。尿蛋白濃度測定試劑盒，購自南京建成公司（批號：20201204）。

3 模型建立及分組

采用單純隨機抽樣法將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、參地顆粒組、纈沙坦組4組，每組各10只。除正常組外，其余30只大鼠均采用大鼠尾靜脈注射C-BSA建立MN模型[7]：預(yù)免疫：取C-BSA 100mg溶解于生理鹽水15mL中與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化。取混合液1ml分別在 40 只大鼠雙側(cè)腋下、腹股溝作多點皮下注射，隔日1次，共3次。正式免疫：將C-BSA按照16mg·kg-1·d-1尾靜脈注射，每周3次，連續(xù)4周。用代謝籠中收集24h尿液進行尿蛋白檢測，按24h尿蛋白量≥20mg視為建模成功，＜20mg者剔除。正常組大鼠以相同的注射方式注射等體積生理鹽水。

4 給藥方法

造模成功后開始灌胃，正常組、模型組均給予10ml/kg·d 0.9%的氯化鈉注射液灌胃；參地顆粒組給予參地顆粒水溶液按4.0g/kg·d灌胃；纈沙坦組將纈沙坦膠囊混懸液按20mg/kg·d灌胃。3ml/次，1次/d，連續(xù)給藥8周。

5 標本采集及檢測方法

給藥8周后代謝籠收集大鼠24h尿液，用比色法測定尿蛋白濃度（24h尿蛋白量＝尿蛋白濃度×24h尿量）。2%的戊巴比妥麻醉大鼠，摘取右側(cè)腎臟放入凍存管內(nèi)，投放到液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存，以備Western blot檢測。

Western blot檢測方法：取100mg腎組織加入1ml組織裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，10000r/min離心40min，收集上清液，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白含量。100℃變性10min，每組取等量蛋白質(zhì)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。10%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉4h后，置入加有一抗的10%奶粉-TBST，4℃冰箱孵育過夜（一抗稀釋比例GRP78、CHOP為1:500；Nephrin、Podocalyxin為1:1000；β-actin為1:1000）；次日用TBST漂洗后加入HRP標記的二抗（稀釋比例為1:1000），室溫孵育2h；TBST漂洗，加入ECL后曝光；用Fluors凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對含量以目的蛋白吸光密度×面積與β-actin條帶的比值表示。

6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均值±標準差來表示，兩組間比較采用t檢驗；若資料不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗；P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠24hUpro比較

模型組大鼠的24hUpro顯著高于正常組（P＜0.05）。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠的24hUpro顯著降低（P＜0.05）；且參地顆粒組大鼠的24hUpro變化顯著優(yōu)于纈沙坦組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠24hUpro比較（ ±s）

表1 各組大鼠24hUpro比較（ ±s）

注：模型組與正常組比較：*P＜0.05；各治療組與模型組比較：▲P＜0.05；參地顆粒組與纈沙坦組比較：△P＜0.05。

組 別 例數(shù) 24hUpro/mg·24h-1正常組 8 5.62±1.55模型組 6 33.54±4.85*參地顆粒組 7 22.65±6.20▲△纈沙坦組 6 26.38±5.03▲

2 各組大鼠腎臟中GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin蛋白表達比較

與正常組比較，模型組大鼠腎組織中的GRP78、CHOP、Beclin1蛋白相對表達量均顯著增加，而Nephrin、Podocalyxin蛋白相對表達量顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，參地顆粒組和纈沙坦組大鼠腎組織中的GRP78、CHOP表達量均顯著減少，而Nephrin和Podocalyxin表達量則顯著升高（P＜0.05）；且參地顆粒組GRP78、CHOP、Podocalyxin的表達變化均顯著優(yōu)于纈沙坦組（P＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達比較

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠腎臟GRP78、CHOP、Nephrin、Podocalyxin相對表達量比較（±s）

注：模型組與正常組比較：*P＜0.05；各治療組與模型組比較：▲P＜0.05；參地顆粒組與纈沙坦組比較：△P＜0.05。

組別 例數(shù) GRP78 CHOP Nephrin Podocalyxin正常組 8 0.45±0.03 0.41±0.02 0.63±0.05 0.68±0.02模型組 6 0.90±0.04* 0.92±0.07* 0.29±0.04* 0.27±0.03*參地顆粒組 7 0.66±0.03▲△ 0.61±0.03▲△ 0.44±0.02▲ 0.55±0.03▲△纈沙坦組 6 0.78±0.01▲ 0.74±0.03▲ 0.40±0.03▲ 0.39±0.04▲

討 論

MN的發(fā)病主要是由于抗原-抗體免疫復(fù)合物沉積在腎小球毛細血管袢，導(dǎo)致基底膜彌漫性增厚。但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，足細胞病變也參與到MN的核心發(fā)病機制中[8]。由于足細胞缺乏再生能力，因此足細胞的損傷是導(dǎo)致腎小球疾病進展直至走向ESRD的主要原因。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細胞器，在缺血、缺氧、氧化應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境被破壞，從而導(dǎo)致未折疊蛋白的積累，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）[9]。足細胞含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，ERS是MN重要的發(fā)生機制之一，適度的 ERS 是細胞應(yīng)對外界刺激的保護機制，但發(fā)生在腎組織內(nèi)持續(xù)或過強的應(yīng)激反應(yīng)是誘導(dǎo)足細胞損傷的機制之一[10]。足細胞損傷后導(dǎo)致腎小球濾過屏障受損，進而導(dǎo)致持續(xù)蛋白尿的生成。GRP78、CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子，GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，參與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾，在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時明顯增多，故可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志性蛋白[11]，其表達水平反映了細胞應(yīng)激的嚴重程度。CHOP 是 ERS信號通路下游重要的促凋亡因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡和細胞損傷中具有重要作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)多種細胞產(chǎn)生調(diào)亡的關(guān)鍵信號分子[12]。ERS誘導(dǎo)細胞凋亡通路在嚴重ERS時都可以增加CHOP基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，作為MN的經(jīng)典動物模型，C-BSA大鼠腎組織中GRP78、CHOP表達上調(diào)，而足細胞標志蛋白Nephrin、Podocalyxin表達減少，提示C-BSA大鼠出現(xiàn)ERS反應(yīng)增強及足細胞損傷。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來的代謝紊亂和免疫力下降等方面有獨特的作用。膜性腎?。∕N）是慢性腎炎的主要病理類型，其基本病機是脾腎虧虛、精微下注[13]。參地顆粒是根據(jù)清朝新安醫(yī)學(xué)名家程林所著《圣濟總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微，前期研究顯示該方能夠通過降低炎癥因子釋放和抑制炎癥反應(yīng)，具有改善慢性腎炎患者的臨床癥狀，減輕蛋白尿等作用[14]。且近期研究已證實其對慢性腎炎患者和模型大鼠的免疫功能紊亂具有一定調(diào)節(jié)作用[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，中藥參地顆粒具有減輕C-BSA大鼠的足細胞損傷及蛋白尿作用；并且能夠抑制過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進而發(fā)揮對足細胞的保護性作用。但是對于ERS在足細胞損傷中的具體機制過程，以及參地顆粒對上述機制的干預(yù)靶點等有關(guān)研究，仍有待于我們進一步深入探討。