李金菊，吳迪，方朝暉

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230012 2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031 3 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥防治糖尿病研究所 安徽合肥 230031

2型糖尿病一種以胰島素分泌不足或絕對不足、胰島素抵抗以及脂質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝性疾病，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及人口老齡化的進(jìn)展，以糖脂代謝紊亂特征的疾病發(fā)生率逐年增加，流行病學(xué)調(diào)查顯示，2019年全球糖尿病患病率估計為9.3%（4.63億人），到2045年將上升到10.9%（7億人）[1]，中國人群血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.40%，這些代謝性疾病的治療是個漫長甚至終身的過程。目前，很多治療藥物不光成本高、副作用大，而且不能完全有效地遏制糖尿病及其引起的靶器官損害和并發(fā)癥的發(fā)生，給人民生活和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，探求副作用低、成本少的新型降血糖藥物和食品一直是人們所關(guān)注的問題。

桑葉為?？浦参锷５母稍锶~[2]，屬藥食同源植物，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》“桑葉氣味苦寒，有小毒，主除寒熱出汗”，自古便有人用桑葉做代茶飲防治糖尿病，例如《本草綱目》中記載：“葉煎代茶、能止消渴”“炙熟煎飲、代茶止渴”[3]?，F(xiàn)代中藥學(xué)教材記載桑葉味甘、苦、性寒，歸肺、肝經(jīng)；具有疏風(fēng)散熱、潤燥清肺、平抑肝陽、清肝明目、凉血止血等功效，可用于風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花等癥[4]。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中含有黃酮類化合物包括黃酮類、黃銅醇類、二氫黃酮類；生物堿類化合物包括1-脫氧野尻霉素（DNJ）、N-甲基-1-脫氧野尻霉素（NMe-DNJ）；多酚酸類、香豆素類、氨基酸類、多糖類、維生素類、脂類、礦物質(zhì)類等多種化學(xué)成分[5]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保肝護(hù)肝的作用。天然桑葉中的生物堿（DNJ）含量≦0.1%，天然桑芽降糖生物堿茶（桑葉紅茶片）中生物堿（DNJ）含量通過檢測結(jié)果為0.25%～0.45%，平均值為0.35%，前期研究發(fā)現(xiàn)桑葉紅茶可以改善糖尿病及糖尿病前期人群臨床癥狀，降低血糖水平[6]。故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上開展動物實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探討桑葉紅茶片對2型糖尿病模型大鼠的干預(yù)效果及可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物與飼養(yǎng)

采購SPF級別的雄性SD大鼠60只，鼠齡7～8周，體重在220～300g左右，于安徽醫(yī)科大學(xué)動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)（許可證SCXK（皖）2017001），室溫控制在20～25℃，濕度40～70℃，室內(nèi)保持良好干燥、采光、通風(fēng)條件，大鼠自由飲食、活動自如，皮毛光亮，反應(yīng)靈敏，高脂飼料購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2 實(shí)驗(yàn)藥物

桑葉紅茶片（六安玫瑰紅茶品有限公司、安慶麥寶瑞生物科技有限公司，食品許可證編號：SC10632012500510，規(guī)格0.7g/片），鹽酸二甲雙胍片（信宜天平藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字號H31020246，規(guī)格0.5g/片）。

3 主要試劑與儀器

水合氯醛，濟(jì)南嘉格生物科技有限公司。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國Sigma公司）。血糖儀、血糖試紙，美國強(qiáng)生。-80℃冰箱，中國榮事達(dá)BCD-245F。7080型全自動生化分析儀，日本日立公司。低密度脂蛋白試劑盒、檸檬酸鈉緩沖液、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒均購自合肥安啟生物科技有限公司。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 模型制備 取SPF級雄性SD大鼠60只，隨機(jī)選取10只大鼠分為正常組，用普通的大鼠飼料喂養(yǎng)至結(jié)束，其余50只大鼠予以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，再予以高脂飼料配合高糖飲水喂飼2周后造模，造模前大鼠禁食12h，以pH=4.5的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制1%濃度的STZ，按35mg/kg的劑量于腹腔單次注射給藥，72h后大鼠尾靜脈取血測空腹血糖≥11.1mmol/L即視為2型糖尿病大鼠造模成功，血糖值低于11.1mmoL/L 3天后再次予以35mg/kg STZ腹腔注射，測血糖達(dá)標(biāo)者視為造模成功，過程中死亡1只，2只血糖未達(dá)標(biāo)，最終造模成功47只。

4.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將造模成功大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組9只、桑葉紅茶高劑量組9只、桑葉紅茶中劑量組9只、桑葉紅茶低劑量組10只和陽性對照組10只。依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]給藥劑量按人與動物千克體質(zhì)量換算，予以桑葉紅茶片低劑量286mg/kg；中劑量572mg/kg；高劑量1.144g/kg灌胃，陽性對照組予以二甲雙胍300mg/kg灌胃，正常組與模型組大鼠予以5ml/kg/d的生理鹽水灌胃處理，1次/d，連續(xù)給藥8周，實(shí)驗(yàn)期間給藥組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂飼至結(jié)束。

5 觀察指標(biāo)與檢測方法

5.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 觀察造模前后各組大鼠的攝食量、飲水量、毛色、精神狀態(tài)、尿量及日?；顒訝顩r等變化。

5.2 大鼠血糖及體重測量 用血糖儀分別測量并記錄造模前后及給藥后4周、8周大鼠尾靜脈血糖水平，測量血糖前分別給每只大鼠測量體重。

5.3 大鼠血脂指標(biāo)檢測 末次給藥后禁食12h，各組大鼠均以3.5%水合氯醛溶液30mg/kg腹腔注射麻醉，暴露腹腔，無菌條件下快速腹主動脈取血，將收集的血液靜置2h后，以3500r/min離心15min，取上層血清，取血清樣本，全自動生化儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度，保存大鼠組織，以供其他檢測。

5.4 大鼠炎癥因子指標(biāo)檢測 ELISA法測定大鼠血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，以標(biāo)準(zhǔn)品的在450nm波長下所測的吸光度（A）、標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。將所得各組A分別帶入方程計算含量。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 各組大鼠血糖水平的影響 mmoL/L

表2 各組大鼠血脂水平 mmoL/L

結(jié) 果

1 大鼠一般情況的影響

正常組大鼠精神狀態(tài)可，飲食正常，活動可，反應(yīng)靈敏，體毛光亮順滑。模型組大鼠出現(xiàn)精神不佳、消瘦、尿量增加、毛色枯槁、活動減少等癥狀，治療組大鼠諸癥狀較模型組改善。

2 對大鼠血糖水平的影響

模型組大鼠血糖水平較正常組升高（P＜0.01），藥物干預(yù)各組大鼠血糖水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 對大鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中HDL-C水平顯著降低，TC、TG及LDL-C水平顯著升高，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組大鼠血清中的TC、TG及LDL-C水平均降低，HDL-C水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明桑葉紅茶可改善2型糖尿病大鼠的血脂水平，桑葉紅茶改善2型糖尿病大鼠的血脂水平的作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，以高劑量的作用較顯著。

4 對大鼠炎癥因子指標(biāo)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各治療組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。桑葉紅茶降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α的作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，以高劑量的作用最為顯著。

表3 各組大鼠炎癥指標(biāo)因子水平 pg/mL

討 論

2型糖尿病已逐漸發(fā)展成為一種呈現(xiàn)出全球不斷增長趨勢的慢性疾病，初期2型糖尿患者并無特殊臨床癥狀，故2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有一定的隱匿性。但高血糖對機(jī)體損傷是一個逐漸發(fā)展的過程，但隨著時間的推移，高血糖會不斷加重各組織臟器的損傷，從微血管、神經(jīng)損傷可逐漸發(fā)展至大血管損傷和主要臟器受損，導(dǎo)致腦、心臟、腎臟、周圍神經(jīng)、視網(wǎng)膜、足部、皮膚等多組織臟器均受到影響[8]，糖尿病及其并發(fā)癥對個人及其家庭、衛(wèi)生系統(tǒng)和國民經(jīng)濟(jì)具有重大的經(jīng)濟(jì)影響，調(diào)查顯示，2019年全球糖尿病直接衛(wèi)生支出估計為7600億美元，預(yù)計到2030年將增長至8250億美元[9]。目前全球針對糖尿病的治療主要是采用口服藥物或皮下注射胰島素的方法控制機(jī)體高血糖狀態(tài)，但是隨著這些藥物應(yīng)用時間的增加，越來越多的副作用和并發(fā)癥也逐漸出現(xiàn)。近些年來，科研人員發(fā)現(xiàn)部分中藥及其提取成分對糖尿病的防治有著明顯作用，同時還存在對機(jī)體副作用小這一明顯優(yōu)勢。桑葉味甘，性溫，對內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病具有一定的調(diào)節(jié)作用[10]，本實(shí)驗(yàn)以2型糖尿病大鼠為研究對象，探究桑葉紅茶治療2型糖尿病的作用及相關(guān)機(jī)制。

糖尿病脂質(zhì)代謝紊亂表現(xiàn)為血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平的升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）下降，脂代謝異常會促進(jìn)胰島素分泌，造成高胰島素血癥，而且也能造成胰島β細(xì)胞的損害，產(chǎn)生脂毒性。同時，脂質(zhì)代謝紊亂在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起作用，從而導(dǎo)致糖尿病大血管病變?nèi)绻跔顒用}粥樣硬化性心臟病、腦血管疾病、下肢血管病變等并發(fā)癥的發(fā)生[11]，因此對于糖尿病的治療中，也要關(guān)注血脂的代謝，本研究顯示，桑葉紅茶能夠顯著降低TC、TG、LDL-C水平，同時升高HDL-C水平，表明桑葉紅茶對2型糖尿病模型大鼠表現(xiàn)的脂代謝異常具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

2型糖尿病是一種炎癥相關(guān)性疾病，炎癥反應(yīng)可以通過各種轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的分子途徑、氧化應(yīng)激反應(yīng)等激活各種促炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)通過干擾胰島素信號通路從而誘導(dǎo)胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病及脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生[12]。同時研究表明，胰島素抵抗的患者通常也存在著低級別的全身或者脂肪組織炎癥，炎癥因子的釋放則可能加重胰島素抵抗的發(fā)生。因此，改善或預(yù)防炎癥因子的產(chǎn)生將在糖尿病患者的血糖達(dá)標(biāo)及改善預(yù)后有較大意義[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2型糖尿病模型大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)量顯著升高引發(fā)炎癥反應(yīng)，桑葉紅茶片給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著下調(diào)，表明桑葉紅茶片能夠降低2型糖尿病模型大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，桑葉紅茶片對2型糖尿病大鼠的糖脂代謝、炎癥因子的產(chǎn)生具有較好的干預(yù)作用，其作用機(jī)制可能調(diào)控炎癥反應(yīng)有關(guān)。該研究為桑葉紅茶片在抗2型糖尿病健康產(chǎn)品開發(fā)方面的應(yīng)用提供了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。