張 苗 周生財 吳夢潔 童再康 韓 瀟 張俊紅 程龍軍

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300； 2.麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院 麗水 323000)

磷元素(P)是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，在生命大分子構(gòu)成、能量轉(zhuǎn)移、代謝調(diào)控和蛋白質(zhì)活化等生命活動中發(fā)揮重要作用(Raghothama, 1999)。植物主要吸收土壤中的可溶性無機(jī)磷，但土壤中磷主要以非生物活性的有機(jī)磷存在，限制了植物對土壤中磷的利用。而過量施用磷肥，不但增加農(nóng)作物生產(chǎn)成本，還會對環(huán)境造成污染(Daveetal., 2010; Vanceetal., 2003)。因此，在研究植物吸收、利用磷機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)代分子育種技術(shù)，提高植物自身吸收、利用磷的效率對農(nóng)作物和林木種植經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

土壤中可利用磷較少，植物在長期進(jìn)化基礎(chǔ)上形成了一系列分子水平上的適應(yīng)機(jī)制(Chiouetal., 2011; Chienetal., 2018)，明確植物在磷吸收、利用方面的分子機(jī)制是改善植物磷營養(yǎng)狀況的基礎(chǔ)。目前，在分子水平上，已有很多植物磷吸收、轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物在低磷條件下采用的分子調(diào)控策略的研究(Zhangetal., 2014; Wangetal., 2017； Haetal.， 2014)。在植物適應(yīng)低磷脅迫的分子調(diào)控機(jī)制中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了非常重要的作用。其中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子PHR1被認(rèn)為是迄今為止發(fā)現(xiàn)的調(diào)控植物磷饑餓響應(yīng)的最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它通過調(diào)控PS1基因，影響很多磷脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)(Pantetal., 2015； Nilssonetal., 2007)； 低磷環(huán)境下，bHLH32可以作為一個負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控花色素苷的合成及根毛形成過程(Chenetal., 2007)； 轉(zhuǎn)錄因子ZAT6則參與磷相關(guān)的根系發(fā)育以及磷在植物體內(nèi)的分布平衡(Devaiahetal., 2007)。

除此之外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子也在植物磷饑餓脅迫中發(fā)揮重要作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子因其蛋白序列中含有1～2個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域WRKY(WRKYGQK)而得名。它通過識別基因啟動子區(qū)域的W-box元件(C/TTGACT/C)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)(Eulgemetal., 2000)。除WRKY結(jié)構(gòu)域外，WRKY蛋白中一般還含有1～2個其特有的鋅指結(jié)構(gòu)域，參與DNA序列的結(jié)合。根據(jù)其序列特征，鋅指結(jié)構(gòu)域可分為2種類型： C-X4-5-C-X22-23-H-X-H(C2H2型)或C-X7-C-X23-H-X-C(C2HC型)。按照WRKY蛋白所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及鋅指結(jié)構(gòu)類型將它們分為3個亞類。第Ⅰ、Ⅱ亞類所含鋅指結(jié)構(gòu)均為C2H2型，WRKY結(jié)構(gòu)域在第Ⅰ亞類中為2個而在第Ⅱ亞類中為1個； 第Ⅲ亞類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC型(Eulgemetal., 2000)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AtWRKY6、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和水稻(Oryzasativa)的OsWRKY74等都被證明在植物低磷脅迫下參與磷的轉(zhuǎn)運、分配和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對提高植物對低磷環(huán)境的適應(yīng)性發(fā)揮重要功能(Devaiahetal., 2007； Chenetal., 2009； Suetal., 2015； Daietal., 2016)。麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)的58個WRKY基因中有16個在低磷脅迫下表達(dá)發(fā)生明顯變化(Xiongetal., 2013)。大豆(Glycinemax)中GmWRKY45超表達(dá)也能提高植株對低磷脅迫的適應(yīng)性(Lietal., 2019)。在低磷條件下，對植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)功能和調(diào)控機(jī)制的深入研究和分析，不但能豐富對植物磷吸收和利用分子機(jī)制的了解，還有利于挖掘植物中參與磷吸收、利用相關(guān)的WRKY基因成員并加以利用。

目前對植物中WRKY基因低磷條件下響應(yīng)機(jī)制的研究還主要在幾種模式植物中，其他植物中報道很少。我國南方農(nóng)林用地主要以可吸收磷含量低的酸性紅壤土為主，土壤中低生物活性的磷會嚴(yán)重限制農(nóng)林植物的經(jīng)濟(jì)效益(于姣妲等, 2017)。針對我國南方較為廣泛種植的農(nóng)林植物，研究WRKY基因家族成員與低磷脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系，對利用分子育種策略改善它們的種植效益是非常有意義的探索。

楠木(Phoebe)主要在浙江、福建、江西等地分布，是中國特有的珍貴樹種，材質(zhì)優(yōu)良，氣味芬芳，既可作用材樹種，生產(chǎn)名貴的家具，又可作觀賞用的行道樹。但由于其過度采伐逐漸成為瀕危保護(hù)樹種(Chenetal., 2020)。近年來，楠木人工林的培育開始興起，在資源保存和利用上發(fā)揮了重要作用，但在栽培和育種上仍有許多問題需要解決。尤其是楠木不耐貧瘠，在南方低磷立地條件下種植，生長會受到嚴(yán)重影響(賀維， 2015)。因此，研究楠木磷吸收利用的相關(guān)分子機(jī)制，推進(jìn)磷高效利用的楠木品種選育工作，對楠木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本研究以我國南方分布范圍比較廣的閩楠(Phoebebournei)為研究材料，在全基因組范圍內(nèi)鑒定了68個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分析了它們的基因結(jié)構(gòu)和蛋白編碼特征。基于轉(zhuǎn)錄組測序，對正常供磷、缺磷處理下的閩楠幼苗進(jìn)行了WRKY基因家族成員的表達(dá)分析，初步鑒定了楠木中磷脅迫響應(yīng)的WRKY基因，為進(jìn)一步研究這些基因在磷吸收、利用分子調(diào)控途徑中發(fā)揮的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

閩楠半同胞家系種子采集于浙江慶元楠木種子園，沙藏后第2年春播種，6個月后，選取長勢一致的植株作為試驗材料。缺磷試驗在植物培養(yǎng)箱(Snijders MC1000, 荷蘭) 中進(jìn)行，植株培養(yǎng)條件為： 白天溫度25 ℃，夜間溫度22 ℃； 相對濕度75%； 日照16 h/黑暗8 h； 光照強(qiáng)度150 μmol·m-2s-1。

1.2 PbWRKY家族基因成員鑒定

利用在線網(wǎng)站(http:∥pfam.xfam.org)下載WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(pfam03106)，通過HMMER(ver 3.1)軟件中hmmsearch模塊在閩楠基因組蛋白序列文件中進(jìn)行檢索，E值設(shè)定為< e-20，去掉重復(fù)序列。對獲得的PbWRKY基因進(jìn)行染色體定位分析，并對PbWRKY基因進(jìn)行編號、命名。

1.3 PbWRKY家族基因及其編碼蛋白特性

對68個PbWRKY及擬南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY40、AtWRKY42、AtWRKY45、AtWRKY75和水稻OsWRKY74的蛋白序列用MEGA7.0構(gòu)建1 000個重復(fù)的無根鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。用在線軟件GSDS2.0(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn)分析PbWRKY基因的外顯子、內(nèi)含子的數(shù)目和位置。利用Protaram(https:∥web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站對PbWRKY家族成員編碼蛋白進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量、等電點等理化特性預(yù)測。在https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi上的Batch CD-Search程序搜索PbWRKY蛋白序列中的WRKY結(jié)構(gòu)域和存在的其他結(jié)構(gòu)域。利用TBtools(ver.1.075)(Chenetal., 2020)作圖展示。氨基酸序列通過ClustalX(ver 1.81)進(jìn)行多序列比對，確定WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域的位置。

1.4 PbWRKY家族基因組織特異性表達(dá)分析

以3年生閩楠半同胞家系植株為材料，選取根、韌皮部和形成層、木質(zhì)部和葉片為材料提取RNA，每個樣本重復(fù)3次，質(zhì)檢后的RNA用于RNA-seq文庫構(gòu)建，而后采用Illumina NovaseqTM6000 進(jìn)行測序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征見表1。轉(zhuǎn)錄組測序由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.5 缺磷處理閩楠幼苗轉(zhuǎn)錄組分析

試驗材料分為對照組和缺磷處理組，每組各15株，每5株作為一個生物學(xué)重復(fù)。栽培方式為水培，對照組(Control，CK)采用1/4霍格蘭營養(yǎng)液，缺磷處理組(deficiency of phosphorus, Treatment)采用去除磷元素的1/4霍格蘭營養(yǎng)液，每3天更換1次營養(yǎng)液。根據(jù)前期預(yù)試驗，采取缺磷處理60天作為取樣時間點，分別取對照組與處理組各5株苗的根和成熟葉片，迅速液氮冷凍，作為1個重復(fù)用作RNA提取。試驗重復(fù)3次。轉(zhuǎn)錄組測序方法同1.4，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征見表1。

1.6 缺磷處理閩楠幼苗有效磷含量測定

分別取對照組與處理組各5株苗的根和成熟葉片樣品各1 g，作為1個重復(fù)，將樣品放入凍干機(jī)抽離水分，充分研磨后，測定有效磷含量。分別稱取樣品0.2 g于10 mL離心管中，加蒸餾水浸提，少量多次定容至 25 mL容量瓶中，并用0.22 μm水系濾膜過濾，溶液待測。利用間斷化學(xué)分析儀BluVisionTM(Skalar，荷蘭)測定磷含量。試驗重復(fù)3次。

磷含量(mg·g-1)=顯色液濃度(mg·L-1)×顯色體積(mL)/干質(zhì)量(g)×1 000。

1.7 RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄和實時定量qPCR

將液氨中冷凍的樣品混合均勻，充分研磨。利用RNA植物多糖多酚提取試劑盒(TIANGEN，北京)提取組織總RNA。并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT(Takara，北京)進(jìn)行cDNA合成。實時定量qPCR試驗中，用Primer3(v.0.4.0)設(shè)計引物(表2)，引物合成由有康生物科技有限公司(杭州)完成。利用SYBR Premix Ex TaqTM II(Vazyme，南京)，在CFX-96-well Real-Time System(Bio-Rad，美國)進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系為： SYBR Premix Ex TaqTM II 5 μL，上下游引物各0.2 μL，稀釋5倍后的cDNA 0.4 μL，超純水4.2 μL，總體積10 μL。反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性1 min； 95 ℃變性10 s，57 ℃退火持續(xù)10 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。內(nèi)參基因為PbEF1α，按照 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理； 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在SPSS(ver 26.0)軟件上進(jìn)行，并用GraphPad Prism(ver 8.0)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbWRKY基因和蛋白序列分析

通過hmmsearch搜索，最終得到68個閩楠WRKY基因。它們分別分布在12條染色體上和1條Scaffold上，呈不均勻分布。3號染色體上數(shù)量最多，有15個； 其次為5號染色體和9號染色體，分別有9個和8個； 1、2、7、8號染色體上各有5個，6和12號染色體上各有4個，4和10號染色體上分別有3個，11號染色體和Scaffold356上各有1個。根據(jù)其在染色體上的定位分別將基因命名為PbWRKY1-68(表3)。所有的PbWRKY基因均含有內(nèi)含子，最少1個，PbWRKY64內(nèi)含子數(shù)目最多，為28個(圖1)?；蜷L度在1 018 bp(PbWRKY38)～39 719 bp(PbWRKY64)之間。編碼氨基酸為169(PbWRKY11)～986(PbWRKY64)個。等電點在5.02(PbWRKY53)～9.81(PbWRKY39)之間。分子質(zhì)量為19.09(PbWRKY11)～111.56 kDa(PbWRKY64)(表3)。

表1 組織表達(dá)與缺磷處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量特征

表2 PbWRKY基因qPCR引物

表3 閩楠WRKY基因及編碼蛋白特性

續(xù)表 Continued

圖1 閩楠WRKY基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

所有PbWRKY蛋白序列均含有1或2個WRKY結(jié)構(gòu)域，其核心蛋白序列為WRKYGQK； 同時含有1～2個WRKY蛋白所特有的鋅指結(jié)構(gòu)域，不同的WRKY基因編碼的蛋白序列中含有的鋅指結(jié)構(gòu)域可能不同，有的為C2H2型，有的則為C2HC型(Eulgemetal., 2000)(圖2)。基于蛋白序列進(jìn)化樹的構(gòu)建及WRKY和鋅指結(jié)構(gòu)域的特征，68個PbWRKY可以分為I、II、III 3個亞類。其中，I亞類中含有14個PbWRKY，它們含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域和2個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域； 第1和2條染色體上的10個PbWRKY (PbWRKY1-10)全部為第I亞類，第I亞類的另外4個成員則集中分布在第3條染色體上，暗示第I亞類是在這3條染色體上進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增的。II、III亞類中都僅含1個WRKY結(jié)構(gòu)域，分別各有47個和7個PbWRKY。但I(xiàn)I亞類中的鋅指結(jié)構(gòu)域與I亞類同為C2H2型，而III亞類中的鋅指結(jié)構(gòu)域則為C2HC型。第Ⅱ亞類中根據(jù)進(jìn)化關(guān)系的不同，又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe 5個子組，Ⅱa和Ⅱc分別含有6個和14個PbWRKY，其他子組都含有9個。Ⅱa和Ⅱb子組的PbWRKY蛋白序列中，除了WRKY結(jié)構(gòu)域之外，還有其他結(jié)構(gòu)域，如PbWRKY64的sec6結(jié)構(gòu)域(pfam06046)、PbWRKY67的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP superfamily，cl21462)、PbWRKY58和PbWRKY59的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(pfam15294)以及Ⅱd子組蛋白的鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pfam10553)等(Droge-Laseretal., 2018； Babuetal., 2006； Yazdanietal., 2020)(圖1)。

2.2 PbWRKY基因組織表達(dá)特異性分析

閩楠根、韌皮部和形成層、木質(zhì)部和葉片的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果(圖3)表明，68個PbWRKY基因在不同組織中的表達(dá)特征可以分為5類： 韌皮部和形成層中相對表達(dá)量較低(5個)； 木質(zhì)部中表達(dá)量高而葉片中表達(dá)量較低(19個)； 韌皮部和形成層中表達(dá)量較高而葉片中表達(dá)量較低(10個)； 根中表達(dá)量相對較高(18個)； 葉片中表達(dá)量高而根中表達(dá)量低(16個)。不同PbWRKY基因組織表達(dá)特異性也有很大區(qū)別，表明它們的功能也有很大不同。

圖2 閩楠WRKY蛋白序列中WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)類型

圖3 閩楠WRKY基因不同組織部位表達(dá)熱圖

2.3 閩楠缺磷處理后有效磷含量的變化

由于不同植物響應(yīng)低磷脅迫的情況不同，根據(jù)前期預(yù)試驗，對6個月正常培養(yǎng)的閩楠幼苗進(jìn)行60天缺磷處理。60天后，缺磷處理的植株側(cè)根數(shù)量相對于對照明顯增多，較發(fā)達(dá)，但地上部表型與對照相比沒有明顯差異。缺磷處理的植株葉和根中有效磷含量均顯著下降(圖4)。正常培養(yǎng)的閩楠葉片有效磷含量平均為1.235 1 mg·g-1，缺磷處理葉片有效磷平均為0.249 0 mg·g-1，降幅為79.8%； 正常培養(yǎng)的閩楠根中有效磷含量平均為4.349 1 mg·g-1，缺磷處理根中有效磷含量平均為0.334 9 mg·g-1，降幅為92.3%。以上結(jié)果說明此時缺磷處理的閩楠植株已經(jīng)處于明顯的磷饑餓狀態(tài)。

圖4 正常培養(yǎng)和缺磷處理閩楠60天后葉片(A)和根(B)中有效磷含量變化

2.4 缺磷脅迫下PbWRKY基因表達(dá)分析

缺磷處理的閩楠幼苗葉、根的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明： 與對照相比，缺磷處理植株葉和根組織中表達(dá)差異達(dá)到2倍以上的PbWRKY基因共有21個，占PbWRKY基因總數(shù)目的30.9%(表4)。所有差異表達(dá)基因在缺磷處理的葉片中均被誘導(dǎo)，PbWRKY66誘導(dǎo)最強(qiáng)，誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)到了18.30倍。而根中表達(dá)差異達(dá)到2倍以上的基因共有5個，分別為PbWRKY52、PbWRKY55、PbWRKY56、PbWRKY65和PbWRKY66。在根中，它們在缺磷條件下表達(dá)均受到抑制。因此，這5個基因在缺磷處理60天的閩楠植株中有一個共同的表達(dá)特點，即在葉片中受缺磷誘導(dǎo)，而在根中受缺磷抑制。抑制最強(qiáng)的也是PbWRKY66，表達(dá)量僅為對照的0.091倍。

2.5 缺磷脅迫下PbWRKY基因表達(dá)的qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組的可靠性，將21個差異表達(dá)的PbWRKY基因進(jìn)行了qPCR驗證(圖5)。結(jié)果表明，這些基因的qPCR結(jié)果除了在差異表達(dá)倍數(shù)上有所浮動外，表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相吻合。說明轉(zhuǎn)錄組測序中基因表達(dá)的結(jié)果具有可靠性。在這21個基因中，有與參與擬南芥磷脅迫相關(guān)的WRKY基因相似程度很高的PbWRKY基因(圖6)。如與AtWRKY6、AtWRKY42同屬于Ⅱb子組的PbWRKY50、PbWRKY51、PbWRKY61等，它們都在葉片中受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)；PbWRKY20則與AtWRKY45和AtWRKY75同屬于Ⅱc子組，該基因也表現(xiàn)為缺磷下葉片中的誘導(dǎo)表達(dá)； 而與AtWRKY40和AtWRKY18氨基酸序列相似程度較高的有PbWRKY52、PbWRKY65和PbWRKY66，這3個基因的表達(dá)模式均屬于缺磷脅迫下葉片中被誘導(dǎo)而根中被抑制。其他差異PbWRKY基因則表現(xiàn)為在葉片中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

表4 閩楠幼苗缺磷處理60天后PbWRKY差異表達(dá)基因

圖5 qPCR分析差異基因表達(dá)量

圖6 PbWRKY和參與缺磷響應(yīng)的AtWRKY、OsWRKY蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)高等植物基因組中，WRKY基因成員數(shù)目眾多。如擬南芥有72個(Eulgemetal., 2000)，水稻有102個(Rossetal., 2007)，毛果楊(Populustrichocarpa)有122個(Heetal., 2012)，大豆中甚至達(dá)到了176個(Songetal., 2016)。本研究在閩楠中共鑒定出68個WRKY基因。這些基因編碼蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域保守性很強(qiáng)，僅PbWRKY62的WRKY結(jié)構(gòu)域第6位氨基酸由“Q”變?yōu)椤癒”，這種變異會導(dǎo)致其結(jié)合的順式作用元件由W-box變?yōu)閃K-box(TTTTCCAC)，進(jìn)而引起調(diào)控基因上的差異(Verketal., 2008)?；赪RKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特點，PbWRKY蛋白也分為I、II、III 3個亞類。一般認(rèn)為亞類I是進(jìn)化上較為古老的一類，含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域(Zhangetal., 2005)。而數(shù)量最多的亞類II根據(jù)氨基酸序列的相似性及進(jìn)化關(guān)系，又可被分為5個不同的子組，各子組間屬于非單源性進(jìn)化關(guān)系(Rushtonetal., 2010)。但從PbWRKY的進(jìn)化關(guān)系上看，分類情況并非如此簡單，如PbWRKY37盡管含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，但進(jìn)化分析表明它不屬于任何一個已知亞類II的子組。這種情況在其他植物中也有發(fā)現(xiàn)，如擬南芥中的AtWRKY38和AtWRKY52(Eulgemetal., 2000)。麻風(fēng)樹中的WRKY家族成員也有類似情況(Xiongetal., 2013)。表明PbWRKY家族成員編碼蛋白序列比基于結(jié)構(gòu)域的分類具有更大多樣性，暗示基因功能分化也更為復(fù)雜。

PbWRKY基因組織表達(dá)特異性模式呈多樣性，在一定程度上也表明了不同PbWRKY基因成員可能發(fā)揮不同功能。而且，進(jìn)化上親緣關(guān)系比較近的PbWRKY基因，組織特異性表達(dá)模式也類似。如同屬于亞類I的PbWRKY2、PbWRKY3、PbWRKY7、PbWRKY18和PbWRKY19，它們都屬于韌皮部和形成層表達(dá)受抑制的類型；PbWRKY20、PbWRKY32、PbWRKY33、PbWRKY41、PbWRKY46和PbWRKY68均為IIc子組中成員，它們在閩楠木質(zhì)部表達(dá)量最高。由此可見，進(jìn)化上親緣關(guān)系較近的PbWRKY成員，其功能上可能具有一定的相關(guān)性。

WRKY基因在低磷脅迫中發(fā)揮著非常重要的作用。擬南芥中AtWRKY6和AtWRKY42作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控磷轉(zhuǎn)運體PHO1基因的表達(dá)，低磷條件下被抑制表達(dá)(Chenetal., 2009； Suetal., 2015)；AtWRKY45則可以通過結(jié)合在另一個磷轉(zhuǎn)運體PHT1基因的啟動子區(qū)域激活它的表達(dá)(Wangetal., 2014)。另外，AtWRKY18和AtWRKY40在低磷處理早期的根部也受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)(Linetal., 2011)。水稻中超表達(dá)OsWRKY74的植株，在低磷條件下，相對于對照仍能顯著提高根和地上部分的生長量(Daietal., 2016)。小麥(Triticumaestivum)中與AtWRKY75同源的TaWRKY72b-1在煙草(Nicotiana)中超表達(dá)同樣能提高低磷下植株中的干質(zhì)量、單株磷積累量和磷利用效率(苗鴻鷹等， 2009)。這些結(jié)果都表明，WRKY基因是參與植物磷吸收、轉(zhuǎn)運途徑中分子調(diào)控的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究中缺磷60天的閩楠植株葉片和根中，約有1/3的PbWRKY基因的表達(dá)發(fā)生變化。與擬南芥負(fù)調(diào)控因子AtWRKY6和AtWRKY42親緣關(guān)系最近的PbWRKY50、PbWRKY51和PbWRKY61卻都在葉片中受到誘導(dǎo)，在根中PbWRKY50、PbWRKY61的表達(dá)也有一定程度的上調(diào)(未超過2倍)，這也表明這3個基因與AtWRKY6的功能有所不同。而在缺磷條件下差異表達(dá)的基因中，PbWRKY52、PbWRKY55、PbWRKY56、PbWRKY65和PbWRKY66這5個基因在根中被抑制表達(dá)的倍數(shù)超過2倍。低磷條件下，閩楠植株必然會通過基因調(diào)控作用提高根部吸收、轉(zhuǎn)運磷的效率，因此，這5個基因極有可能是磷吸收轉(zhuǎn)運的負(fù)調(diào)控因子，與AtWRKY6和AtWRKY42功能類似。它們在低磷條件下，通過對磷吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因如PHO1等的抑制，提高植物吸收、利用磷的能力； 但它們同時在葉片中又被誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)倍數(shù)都在5倍以上，暗示它們除了參與根部磷的吸收和轉(zhuǎn)運，還可能參與了低磷條件下葉片中磷元素的再分配，其具體功能值得深入研究。另外，這5個基因中PbWRKY52、PbWRKY65和PbWRKY66在親緣關(guān)系上與擬南芥的AtWRKY18和AtWRKY40最近，它們均屬于IIa子組(圖6)。但AtWRKY18和AtWRKY40分別在低磷處理1 h和2 h后，誘導(dǎo)水平達(dá)到最高，24 h時相對于對照已沒有變化(Linetal., 2011)； 而閩楠中這3個基因在低磷60天時表現(xiàn)出受抑制的現(xiàn)象，是否表明其在磷饑餓前期和后期發(fā)揮的功能不同，或者木本植物中這3個基因與擬南芥中的同源基因具有不同的功能，這些都需要進(jìn)行進(jìn)一步研究加以證實。PbWRKY55和PbWRKY56則與OsWRKY74一樣都屬于第III亞類(圖6)。低磷條件下，OsWRKY74在植株葉片中被穩(wěn)定誘導(dǎo)，而在根中低磷處理早期有比較明顯的誘導(dǎo)，它可能參與了水稻的磷元素的吸收與平衡作用，但具體機(jī)制仍不清晰(Daietal., 2016)。因此PbWRKY55和PbWRKY56低磷條件下特殊表達(dá)模式產(chǎn)生的原因及基因的功能也值得深入探究。與磷吸收轉(zhuǎn)運正調(diào)控因子AtWRKY45和AtWRKY75親緣關(guān)系較近的差異表達(dá)基因為PbWRKY20，但它同樣表現(xiàn)出葉片中被誘導(dǎo)、根中被抑制(抑制表達(dá)未超過2倍)的表達(dá)模式，表明它也可能在植株地上部分和根中都參與了磷的吸收和轉(zhuǎn)運。

另外，其他具有顯著性表達(dá)差異的15個基因都僅在葉片中被誘導(dǎo)表達(dá)，很明顯，它們可能主要參與低磷條件下葉片磷元素的運輸及再分配過程。低磷條件下，植物地上部分的光合作用，生長以及碳的代謝、分配等過程都會受到嚴(yán)重影響，這些過程都與磷元素的再分配有關(guān)(Hideakietal., 1991)。WRKY基因極有可能參與其中，但到目前為止，涉及低磷條件下植株地上部分磷元素的運輸和再分配機(jī)制的研究很少(Wangetal., 2017)。在本研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步解析PbWRKY基因在植株地上部分參與的低磷響應(yīng)分子機(jī)制，對楠木的耐低磷分子輔助育種工作，以及豐富木本植物適應(yīng)磷脅迫的分子調(diào)控機(jī)制也有重要意義。

磷響應(yīng)相關(guān)的基因在磷處理的不同時間下，表達(dá)的模式會有很大的不同，60天缺磷處理盡管使植株處于了明顯磷饑餓狀態(tài)下，但單一處理時間點的選擇在一定程度上限制了低磷條件下WRKY基因表達(dá)分析的全面性，可能會使一些早期參與低磷脅迫響應(yīng)的基因未能被發(fā)現(xiàn)。今后研究應(yīng)該更加系統(tǒng)地分析低磷脅迫下WRKY基因的功能和調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究在閩楠全基因組范圍內(nèi)，篩選鑒定出68個PbWRKY基因，命名為PbWRKY1-68,在所有染色體上都有分布。根據(jù)蛋白序列所含WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)類型，將其分為I、II、III 3個亞類，亞類II 又分為IIa、IIb、IIc、IId、IIe 5個子組，PbWRKY37在亞類II獨立分組。低磷處理60天，共有 21個PbWRKY基因在閩楠葉片和根中發(fā)生顯著性差異表達(dá)，所有21個基因均在葉片中被誘導(dǎo)上調(diào)，其中有5個PbWRKY基因在根中被抑制，表明這21個差異基因可能參與閩楠葉和根中的磷元素吸收、轉(zhuǎn)運和再分配過程。