黎葉　蘇揚(yáng)清　劉欣　趙彥翠

摘要：為探討分離自患病刺參（Apostichopus japonicus）的一株溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染刺參后，刺參體腔細(xì)胞免疫相關(guān)基因的響應(yīng)變化，分別給刺參注射100 μL生理鹽水（對(duì)照組）和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液（實(shí)驗(yàn)組），用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)24 h內(nèi)刺參體腔細(xì)胞Lys、Rel和p105基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，注射生理鹽水對(duì)刺參體腔細(xì)胞Lys、Rel和p105基因表達(dá)量無(wú)顯著影響。感染溶藻弧菌后，實(shí)驗(yàn)組刺參體腔細(xì)胞中溶菌酶基因的表達(dá)量在24 h顯著升高，且1 h和24 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;刺參體腔細(xì)胞中p105基因在感染后表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，3 h達(dá)到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;刺參體腔細(xì)胞Rel基因表達(dá)量在感染后無(wú)顯著變化?？梢?jiàn)刺參感染溶藻弧菌后其體腔細(xì)胞Lys和p105基因的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)迅速響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：刺參（Apostichopus japonicus）;溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）;體腔細(xì)胞;基因表達(dá)

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）屬于弧菌科，弧菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種常見(jiàn)的海洋致病菌，對(duì)魚(yú)、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物都有較強(qiáng)的致病性[1-4]。溶藻弧菌會(huì)在侵襲和增殖過(guò)程中對(duì)機(jī)體造成細(xì)胞和組織損傷以及其代謝產(chǎn)物干擾和破壞機(jī)體的局部或全身的正常新陳代謝或機(jī)能[3-5]。盧芷程等[5]的研究結(jié)果表明溶藻弧菌感染凡納濱對(duì)蝦后會(huì)啟動(dòng)其免疫機(jī)制并產(chǎn)生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）以對(duì)抗病原菌入侵，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)抗氧化系統(tǒng)會(huì)被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡納濱對(duì)蝦感染溶藻弧菌后，需要不斷保持較高的免疫水平，其體內(nèi)的3種Toll樣受體（Toll-like receptors）基因在血淋巴與鰓中的表達(dá)量均顯著升高。溶藻弧菌也是刺參病害的主要致病菌之一[7]，但關(guān)于其對(duì)刺參免疫的研究較少。刺參體腔細(xì)胞在刺參非特異性免疫中起著非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺參體腔細(xì)胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征機(jī)體對(duì)細(xì)菌性病原抵抗能力的重要指標(biāo)[9]。核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路是先天性免疫中最為重要的途徑，Rel、p105是該信號(hào)通路上重要的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)Rel、p105基因已在刺參上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺參體腔細(xì)胞的非特異性免疫，選取刺參體腔細(xì)胞溶菌酶（Lys）、Rel、p105基因?yàn)槟繕?biāo)基因，探討刺參體腔細(xì)胞對(duì)溶藻弧菌（從患病刺參體壁分離）刺激后24 h內(nèi)Lys、Rel、p105免疫基因的響應(yīng)，為進(jìn)一步探究刺參抵抗溶藻弧菌感染的免疫機(jī)理提供基礎(chǔ)參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用刺參購(gòu)買(mǎi)于東方海洋生物科技有限公司。選取平均體重為3 g的健康刺參200頭，暫養(yǎng)于連續(xù)充氣的水箱中，常規(guī)養(yǎng)殖管理，暫養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將刺參分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株分離自患病刺參，經(jīng)16S rDNA鑒定為溶藻弧菌。使用2216E培養(yǎng)基，28 ℃對(duì)其進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜后，離心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）收集菌體，菌體用0.85%的生理鹽水重懸，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至1×109 CFU/mL備用。

1.3溶藻弧菌的急性感染與樣品采集

注射實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，取18頭刺參，每6頭刺參的體腔細(xì)胞混在一起，作為一個(gè)重復(fù)，即為0時(shí)刻的樣本。對(duì)照組每頭刺參體壁注射0.1 mL生理鹽水，多點(diǎn)注射。實(shí)驗(yàn)組每頭刺參體壁注射0.1 mL濃度為1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多點(diǎn)注射。注射后分別在1、3、6、12、24 h取樣，每個(gè)時(shí)刻隨機(jī)取18頭刺參，解剖刺參獲取刺參的體腔液，每6頭刺參的體腔液混合在一起作為一個(gè)重復(fù)樣本，每一時(shí)刻三個(gè)重復(fù)。體腔液轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min，4 ℃離心，去上清，每管體腔細(xì)胞加入1 mL TransZolTM Up（北京全式金），并用槍反復(fù)吹吸，使體腔細(xì)胞裂解，液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于體腔細(xì)胞RNA的提取。

1.4免疫相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

1.4.1刺參體腔細(xì)胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺參體腔細(xì)胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit （北京全式金）試劑盒說(shuō)明提取RNA。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否被降解;用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度。RNA-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2cDNA的合成和熒光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix （北京全式金）試劑盒對(duì)刺參體腔細(xì)胞RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。向無(wú)RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，補(bǔ)足RNase-free Water 至20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育15 min。85 ℃加熱5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)參考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix （北京全式金）試劑盒操作說(shuō)明，進(jìn)行熒光定量PCR。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序?yàn)椋?95 ℃ 30 s;? 95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。以Cytb為內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)量以 2-ΔΔ CT法進(jìn)行計(jì)算[12]。

1.5數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 17.0對(duì)不同時(shí)刻下的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Tukey′s法進(jìn)行多重比較;同一時(shí)刻下的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn);處理間P<0.05則認(rèn)為差異顯著。

2結(jié)果

2.1溶藻弧菌感染后刺參體腔細(xì)胞中Lys mRNA的表達(dá)

溶藻弧菌感染下刺參體腔細(xì)胞Lys表達(dá)量變化如圖 1所示。注射生理鹽水的對(duì)照組在0～24 h內(nèi)Lys表達(dá)量并無(wú)顯著變化（P>0.05）。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的實(shí)驗(yàn)組Lys表達(dá)量在1 h、24 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05）;且24 h的表達(dá)量顯著高于0 h時(shí)的表達(dá)量（P<0.05）。

2.2溶藻弧菌感染后刺參體腔細(xì)胞中Rel mRNA的表達(dá)

溶藻弧菌感染下刺參體腔細(xì)胞Rel表達(dá)量變化如圖 2所示。注射生理鹽水的對(duì)照組在0～24 h內(nèi)刺參體腔細(xì)胞中Rel基因的相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著變化。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的實(shí)驗(yàn)組Rel表達(dá)量在不同時(shí)刻沒(méi)有顯著變化，同一時(shí)刻與對(duì)照組也沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

2.3溶藻弧菌感染后刺參體腔細(xì)胞中p105 mRNA的表達(dá)

溶藻弧菌感染下刺參體腔細(xì)胞p105表達(dá)量變化如圖 3所示。注射生理鹽水的對(duì)照組在0～24 h內(nèi)p105表達(dá)量并無(wú)顯著變化（P>0.05）。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的實(shí)驗(yàn)組p105表達(dá)量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在3 h和6 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），與0 h相比3 h和6 h的實(shí)驗(yàn)組p105表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）。

3討論

溶菌酶作為機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中一種古老的抗菌酶之一，其殺菌特性十分強(qiáng)大，可催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖與N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的 β-（1，4）-糖苷鍵的水解以達(dá)到消亡細(xì)菌的目的[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶藻弧菌（V.alginolyticus）侵染刺參，能顯著上調(diào)溶菌酶基因的表達(dá)，在溶藻弧菌急性感染后的1 h和24 h的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著的差異。這與Li 等[14]用1×107 CFU/mL 燦爛弧菌（Vibrio splendidus）浸泡刺參的研究結(jié)果一致，其結(jié)果顯示V.splendidus刺激能顯著上調(diào)刺參溶菌酶基因的表達(dá)。Wang等[15]在刺參的免疫因子的表達(dá)研究中顯示感染1×109 CFU/mL（V.splendidus）后溶菌酶mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降繼而再上調(diào)的趨勢(shì)，分別在10 min和240 min時(shí)達(dá)到峰值，而本實(shí)驗(yàn)中也顯示出在感染溶藻弧菌（V.alginolyticus）后24 h刺參體腔細(xì)胞中溶菌酶基因的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到峰值。這說(shuō)明弧菌感染后刺參體腔細(xì)胞的溶菌酶基因?qū)Σ≡母腥驹诙虝r(shí)間做出了積極的免疫反應(yīng)，但其對(duì)溶藻弧菌刺激存在階段性的響應(yīng)。

NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)普遍存在于生物體內(nèi)十分重要的調(diào)節(jié)因子，它可控制各種基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。NF-κB因子的表達(dá)和激活與機(jī)體免疫存在著密切的聯(lián)系，Rel、p105又稱為NF-κB1都是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的成員之一，并在海參的免疫中起著重要作用[10，16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染溶藻弧菌（107CFU）后刺參體腔細(xì)胞p105 mRNA在1～24 h內(nèi)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在3、6 h顯著高于對(duì)照組及0 h的表達(dá)量。Wang等[15]用109 CFU燦爛弧菌（V.splendidus）侵染刺參發(fā)現(xiàn)刺參體腔細(xì)胞中p105基因的表達(dá)水平在1、2、4 h連續(xù)顯著升高，在4 h達(dá)到峰值，是對(duì)照組的6.12倍。這表明刺參體腔細(xì)胞p105基因在刺參體腔細(xì)胞的免疫防御機(jī)制中起著重要的作用，但對(duì)109 CFU燦爛弧菌反應(yīng)更為強(qiáng)烈而對(duì)107 CFU溶藻弧菌刺激更為溫和，這有可能與菌液的作用濃度有關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)109 CFU燦爛弧菌刺激后，刺參體腔細(xì)胞中Rel基因的表達(dá)量顯著增加[15]，10 min時(shí)達(dá)峰值，30 min后，表達(dá)量呈下行但在1、2、4 h仍顯著高于初始水平。在本實(shí)驗(yàn)中，溶藻弧菌（V.alginolyticus）（107 CFU）感染后的刺參Rel基因的表達(dá)在1～24 h內(nèi)沒(méi)有顯著變化。由此可見(jiàn)刺參體腔細(xì)胞Rel基因?qū)N爛弧菌和溶藻弧菌的響應(yīng)完全不同。閻慧等[17]用0.2×105 CFU/mL 鰻弧菌（Vibrio anguillarum）侵染中國(guó)對(duì)蝦，在45 min、70 min、2、3、5、8、14、23 h對(duì)Rel基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明在3 h和5 h，血細(xì)胞中Rel基因被顯著下調(diào)，而淋巴器官中的Rel 基因被顯著上調(diào)。由此可見(jiàn)同一病原對(duì)中國(guó)對(duì)蝦不同組織中Rel基因的表達(dá)影響也顯著不同，這提示我們關(guān)于溶藻弧菌對(duì)刺參體腔細(xì)胞Rel基因的影響，應(yīng)該更加密集地設(shè)計(jì)取樣時(shí)間，并且延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間，以更加全面地揭示Rel基因?qū)θ茉寤【碳さ捻憫?yīng)。

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Response of immune-related genes in coelomocytes of sea cucumber

Apostichopus japonicus to Vibrio alginolyticus infection

LI Ye，SU Yangqing，LIU Xin，ZHAO Yancui

（School of Life Science，Ludong University，Yantai 264025，China）

Abstract：In order to explore the response of immune-related genes including Lys，Rel and p105 in coelomocytes of sea cucumber Apostichopus japonicus to the infection of Vibrio alginolyticus （isolated from diseased sea cucumber），sea cucumbers were respectively injected with 100 μL normal saline （control group） and V.alginolyticus at 1×109 CFU/mL （experimental group）.The results showed that injection of normal saline had no significant effect on the expression of Lys Rel and p105 genes in coelomocytes of A.japonicus.After infection with V.alginolyticus，the expression of Lys gene in the coelomocytes of A.japonicus increased significantly at 24 h，and the expression of Lys gene in the experimental group at 1 h and 24 h was significantly higher than those in the control group （P<0.05）.The expression of p105 gene in A.japonicus coelomocytes increased after infection，reached the peak at 3 h，and the expression of p105 gene at 3 h and 6 h was significantly higher than those in the control group （P<0.05）.The expression of Rel gene in coelomocytes of sea cucumber had no significant change after infection with V.alginolyticus.It can be concluded that the expression of Lys and p105 genes in coelomocytes of A.japonicus infected with Vibrio alginolyticus responded rapidly.

Key words：Apostichopus japonicus; Vibrio alginolyticus; coelomocytes; gene expression

（收稿日期：2022-03-14）

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2017MC 045）。

作者簡(jiǎn)介：黎葉（1997-），女，在讀碩士，研究方向：海洋生物學(xué)。E-mail：465906251@qq.com。

通信作者：趙彥翠（1983-），女，副教授，研究方向：海洋生物學(xué)。E-mail：540372423@qq.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.05.002