趙玉超 蔣林樹(shù)

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

過(guò)去幾十年，抗生素由于其能有效抑制動(dòng)物腸道病原微生物的生長(zhǎng)而被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)，但長(zhǎng)期使用抗生素導(dǎo)致了微生物耐藥性增強(qiáng)及在動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留的問(wèn)題，使畜牧行業(yè)認(rèn)識(shí)到必須開(kāi)發(fā)抗生素替代品[1]。含有大量活性物質(zhì)的天然植物提取物具備抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抑制胃腸道甲烷排放等功能[2-3]，被認(rèn)為是具有巨大開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力的飼料添加劑，而受到越來(lái)越多的關(guān)注。認(rèn)識(shí)并優(yōu)化飼用天然植物提取物的制備工藝，對(duì)揭示植物活性功能組分、生物學(xué)作用及機(jī)制，建立功能組分結(jié)構(gòu)、含量和飼喂效果的關(guān)系至關(guān)重要[4]。因此，本文對(duì)主要天然植物功能組分制備方面的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為未來(lái)的研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供借鑒。

1 飼用天然植物活性功能組分研發(fā)前景與行業(yè)現(xiàn)狀

2018年，我國(guó)將黃芩和甘草等117種藥食同源的天然植物列入《飼料原料目錄》。2020年，宣布退出除中藥外促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑品種后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部改革和完善了新飼料添加劑產(chǎn)品審批制度，針對(duì)天然植物提取物在事前咨詢(xún)、縮短研發(fā)周期、數(shù)據(jù)共享和適度放寬檢測(cè)要求方面進(jìn)行了制度優(yōu)化，這激發(fā)了眾多企業(yè)和科研單位研制開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品的積極性，天然植物活性功能組分應(yīng)用研究與開(kāi)發(fā)將迎來(lái)新階段。

在醫(yī)藥健康和食品化工等領(lǐng)域?qū)χ参锘钚晕镔|(zhì)需求的帶動(dòng)下，我國(guó)專(zhuān)業(yè)的植物提取物企業(yè)已經(jīng)超過(guò)1 000家[5]。國(guó)內(nèi)諸多企業(yè)已經(jīng)開(kāi)始針對(duì)飼用提取物產(chǎn)品進(jìn)行投入，并開(kāi)發(fā)了特定產(chǎn)品，如黃芪提取物和絲蘭提取物等[6]。但是，針對(duì)飼用產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的專(zhuān)業(yè)化企業(yè)數(shù)量還非常少，且規(guī)模小，不具備自主研發(fā)能力，產(chǎn)品制備方法不一、標(biāo)準(zhǔn)缺乏、價(jià)格較高。雖然一些產(chǎn)品已進(jìn)行了飼喂試驗(yàn)，但在畜禽生產(chǎn)上并不具備效益優(yōu)勢(shì)，限制了飼用天然植物活性功能組分在動(dòng)物上的商業(yè)化應(yīng)用。這與中小企業(yè)在提取、分離、純化和鑒定所需的新技術(shù)應(yīng)用缺乏、制備工藝優(yōu)化不足有關(guān)。

另外，科學(xué)研究方面，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家往往對(duì)功能組分制備這一環(huán)節(jié)認(rèn)識(shí)不足。誠(chéng)然，現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)的發(fā)展使生物活性化合物的分析比以前更容易，但產(chǎn)品效果仍然取決于制備方法和優(yōu)化的參數(shù)等[7]。制備方法不同有可能導(dǎo)致同類(lèi)產(chǎn)品在動(dòng)物上的研究數(shù)據(jù)難以相互比較，影響了研究結(jié)果的深入解讀和歸納總結(jié)。而隨著制備儀器和工藝的不斷發(fā)展，植物活性功能組分的提取效率、分離純度和鑒定準(zhǔn)確度正在不斷提高，這也將有助于其生理活性的全面研究，促進(jìn)飼用開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)升級(jí)。

1 主要制備工藝概述

飼用天然植物活性功能組分包括酚類(lèi)、生物堿、揮發(fā)油、苷類(lèi)、多糖和有機(jī)酸等。要獲得大量且較純的植物活性功能組分是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及幾個(gè)步驟，包括植物初步篩選、提取、分離純化和結(jié)構(gòu)解析等[8]。圖1展示了飼用天然植物活性功能組分制備研究的基本流程。

UV-DAD:紫外-光電二極管陣列檢測(cè)器 ultra violet-diode-array detector；MS: 質(zhì)譜 mass spectrum；NMR：核磁共振nuclear magnetic resonance；HPLC-MSn：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 high performance liquid chromatography-mass spectrum；GC-MS：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 gas chromatography-mass spectrum；HPLC-SPE-NMR：高效液相-固體萃取-核磁共振聯(lián)用 high performance liquid chromatography-solid phase extraction-nuclear magnetic resonance；UPLC-DAD-TOF-MS：超高壓液相色譜-電二極管陣列檢測(cè)器-飛行時(shí)間質(zhì)譜 ultra-performance liquid chromatography-diode-array detector-time of flight-mass spectrum。

第1步是選擇植物品種和部位。一方面，可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及傳統(tǒng)的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，評(píng)估某種植物試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，選擇合適的物種和部位；另一方面，基于化學(xué)分類(lèi)學(xué)研究，也就是說(shuō)，某些植物類(lèi)別含有特定類(lèi)型的化合物或次級(jí)代謝物，因此與它們的分類(lèi)相關(guān)的植物也可能含有相同的化合物或代謝物。選擇植物后，要收集和鑒定植物材料，即收集特定植物或其部分，如葉、莖、樹(shù)皮、花、種子或根，以供進(jìn)一步分析[10]。

第2步是活性功能組分的提取。傳統(tǒng)溶劑萃取(CSE)主要包括液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)和固相微萃取(SPME)。CSE工藝雖然簡(jiǎn)便易上手，但制備效率低，耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，造成環(huán)境污染。近年來(lái)，超聲輔助萃取(UAE)、微波輔助萃取(MAE)、酶解輔助萃取(EAE)、加壓液體萃取(PLE)、亞臨界水萃取(SWE)、瞬時(shí)控制壓降萃取(DIC)、超臨界二氧化碳萃取(SCE)等新型綠色方法開(kāi)始涌現(xiàn)[7]。

第3步是活性功能組分的分離純化。植物材料的粗提過(guò)程中會(huì)有多種雜質(zhì)同時(shí)被提取出來(lái)，因此，活性功能組分的分離純化十分有必要。傳統(tǒng)的分離純化方法主要是重結(jié)晶法、紙色譜(PC)、柱色譜(CC)和薄層色譜(TLC)。CC和TLC因其方便、經(jīng)濟(jì)，適用多種固定相而仍被廣泛使用。新型的分離方法有分子蒸餾(MD)、凝膠滲透色譜(GPC)、離子交換色譜(IEC)、大孔吸附樹(shù)脂色譜(MARC)、制備型高效液相色譜法(Pre-HPLC)、高速逆流色譜法(HSCCC)、超臨界流體色譜法(SFC)和分子印跡技術(shù)(MIT)等。表1總結(jié)了主要的新型綠色提取、分離純化工藝的原理、所需儀器設(shè)備和優(yōu)缺點(diǎn)。天然植物功能組分多樣且復(fù)雜，制備工藝也呈現(xiàn)出多樣化特征[22-23]。

表1 天然植物活性功能組分的主要新型制備工藝

第4步是活性功能組分的結(jié)構(gòu)解析。通常采用的手段包括薄層色譜、柱色譜、快速色譜、高效液相色譜-傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振光譜、HPLC-二極管陣列檢測(cè)、毛細(xì)管電泳-二極管陣列檢測(cè)、電噴霧等[24]。最后是設(shè)計(jì)體內(nèi)、體外試驗(yàn)對(duì)活性功能組分進(jìn)行生物學(xué)效果驗(yàn)證。

所有這些過(guò)程中，活性功能組分提取和分離純化所用的時(shí)間占比最多，因此選擇合適的制備方法不僅關(guān)系到目標(biāo)產(chǎn)物得率和純度，也關(guān)系到結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性，更關(guān)系到體內(nèi)、體外評(píng)價(jià)的可靠性?；谖墨I(xiàn)總結(jié)，圖2展示了飼用天然植物六大活性功能組分常用的制備方法，下文詳細(xì)介紹這些活性組分的提取和分離純化研究進(jìn)展。

MAE：微波輔助萃取 microwave-assisted extraction；UAE：超聲輔助萃取 ultrasound-assisted extraction；EAE：酶解輔助萃取enzyme-assisted extraction；PLE：加壓液體萃取pressurized liquid extraction；SWE：亞臨界水萃取 subcritical water extraction；SCE：超臨界二氧化碳萃取supercritical CO2 extraction；DIC：瞬時(shí)控制壓降萃取instant controlled pressure-drop；MD：分子蒸餾molecular distillation；MARC：大孔吸附樹(shù)脂色譜 macroporous adsorption resin chromatography；GPC：凝膠滲透色譜 gel permeation chromatography；IEC：離子交換色譜 ion exchange chromatography；Pre-HPLC：制備型高效液相色譜 preparative high performance liquid chromatography；HSCCC：高速逆流色譜 high-speed counter-current chromatography；MIT：分子印跡技術(shù) molecular imprinting technique。實(shí)心圓圈表示常用方法 solid circles denote common methods。

2 不同植物活性功能組分制備方法研究進(jìn)展

2.1 酚類(lèi)化合物

酚類(lèi)化合物是飼用天然植物功能組分中最大的一類(lèi)，結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量豐富多變，在畜禽上被證明具有抗氧化、提高免疫力等功能，主要包括酚酸、黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、異黃酮、香豆素、花青素和多酚等。表2列舉了國(guó)內(nèi)外部分關(guān)于酚類(lèi)化合物制備方法研究中的植物來(lái)源、方法、優(yōu)化條件。眾多提取方法中，MAE和UAE的方法較為成熟，應(yīng)用最廣，最具代表性[25]。Kumar等[26]報(bào)道，采用CSE、EAE和MAE提取大豆皮中的花青素，發(fā)現(xiàn)MAE優(yōu)化后的產(chǎn)量為5 094.9 mg/L，而CSE和EAE分別為(1 246.89±68.45)mg/L和(4 064.77±163.23)mg/L，可見(jiàn)微波輔助具有顯著優(yōu)勢(shì)。Goltz等[27]研究表明，與CSE相比，在優(yōu)化條件下，應(yīng)用UAE使甘菊花中酚類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)量提高了6.1倍，抗氧化能力提高了3.4倍。因此，UAE可以提高酚類(lèi)物質(zhì)的回收率并減少溶劑用量，降低成本，可以作為CSE的最佳替代方法之一。此外，植物基質(zhì)的酶解可以釋放結(jié)合的酚類(lèi)物質(zhì)，果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等被證明可以用于酚類(lèi)物質(zhì)的提取[7]。

表2 酚類(lèi)化合物的新型制備工藝

常用的酚類(lèi)純化方法主要有MARC、超濾膜法和反相HPLC[28]。應(yīng)用最多的是MARC，大孔樹(shù)脂是一種常用的有機(jī)高分子吸附劑，已廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的分離純化，特別是黃酮類(lèi)化合物。樹(shù)脂的選擇應(yīng)考慮其結(jié)構(gòu)和極性，如表面積、孔徑、極性較低的樹(shù)脂對(duì)極性低或非極性化合物有較強(qiáng)的吸附能量[29]。Zhang等[30]采用EAE提取紅松中的黃酮，然后用大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化，使黃酮的純度從33.8%提升到61.7%，進(jìn)而體外試驗(yàn)證明了純化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化性。另外，金屬絡(luò)合也非常適用黃酮類(lèi)化合物的分離純化，利用黃酮和金屬離子形成黃酮-金屬離子絡(luò)合物。經(jīng)過(guò)濾，提取物中不能與金屬反應(yīng)的雜質(zhì)被去除，然后，具有較強(qiáng)絡(luò)合能力的物質(zhì)與絡(luò)合物反應(yīng)，捕獲黃酮-金屬離子絡(luò)合物中的金屬離子，并釋放出黃酮類(lèi)成分，從而增加黃酮類(lèi)化合物的含量。該方法簡(jiǎn)單、高效，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。如Wang等[31]采用MAE結(jié)合膠束萃取了甘草中的黃酮，然后采用金屬絡(luò)合+反溶劑重結(jié)晶法純化，黃酮純度從36.47%提高到90.32%，且具有較強(qiáng)的2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力。

Pre-HPLC是經(jīng)典的分離純化手段，柱效高、分離重復(fù)性好，可進(jìn)行紫外-質(zhì)譜在線檢測(cè)，因而被廣泛使用。Pre-HPLC可進(jìn)一步分為一維(1D-RPLC)和二維(正相×反相，2D-NPLC/RPLC)，其中二維在分離復(fù)雜混合物上效率更高。研究較多還有HSCCC，它是一種無(wú)載體的全液體分配色譜系統(tǒng)。與硅膠、制備型反相HPLC等方法相比，具有樣品回收率高、耗時(shí)少、環(huán)保等特點(diǎn)[32]。因此它特別適用于從植物中分離純化高極性化合物(如多酚)。由于其優(yōu)越的分離能力和回收率，HSCCC在天然植物產(chǎn)物的制備中的應(yīng)用正在穩(wěn)步增長(zhǎng)[33]。例如，Shu等[32]首次采用HSCCC從芍藥花中分離了8種酚類(lèi)化合物，且純度均高于97%。鑒于酚類(lèi)化合物分布的廣泛性及其改善動(dòng)物健康的重要性，大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)是發(fā)展趨勢(shì)，因此，探索低成本的Pre-HPLC和HSCCC將極大促進(jìn)畜牧業(yè)對(duì)植物酚類(lèi)物質(zhì)的利用。

2.2 生物堿

生物堿是存在于天然植物中的堿性含氮有機(jī)化合物，大多含有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。飼用上有研究的生物堿包括苦參堿、石松堿、血根堿，來(lái)源包括苦參根、石松、野百合、博落回等。傳統(tǒng)工藝提取生物堿普遍使用的有機(jī)溶劑有己烷、甲醇、乙醇等，通過(guò)這些溶劑萃取成功制備了生物堿，并證實(shí)了它們的許多特性，如制備后產(chǎn)物得抗膽堿酯酶、抗炎、抗菌、抗真菌和抗病毒活性等[42]。應(yīng)用新方法SCE、PLE、MAE等提取生物堿[42-43]，縮短了提取時(shí)間，減少了溶劑消耗，提高了產(chǎn)物質(zhì)量。與有機(jī)溶劑相比，深共晶溶劑(DES)具有低毒和生物可降解等優(yōu)點(diǎn)，被證明是適合生物堿的新型高效萃取介質(zhì)[44]。Kang等[45]首次采用DES提取苦參根中的苦參堿，結(jié)果表明，DES-2(氯化膽堿∶丙二酸=1∶2，與50%水)和DES-8(氯化膽堿∶乙二醇=1∶2，與30%水)產(chǎn)物得率最高，達(dá)到21.04 mg/g。另外，多技術(shù)組合應(yīng)用也是研究的熱點(diǎn)，如Zhang等[43]組合MAE與雙水相萃取(APTE)從苦參根中提取苦參堿；Tang等[46]組合MAE與濁點(diǎn)萃取，使用Triton X-100-NaCl-HCl制備體系提取野百合中生物堿，這些方法的優(yōu)化和組合使得生物堿得率更高。

生物堿的分離應(yīng)用較多的是CC，研究方向主要集中在填料選擇，包括大孔樹(shù)脂、硅膠等。研究表明，吸附生物堿應(yīng)選擇弱極性樹(shù)脂，以AB-8、D-101和HPD100應(yīng)用最多，需要優(yōu)化上樣量、吸附溫度和樣品液濃度等[47]。但由于大孔樹(shù)脂質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致純化效果不穩(wěn)定，往往回收率很低，特別是含量低的生物堿容易損失。硅膠作為另一種常用的吸附劑也被不斷改進(jìn)，質(zhì)量比大孔樹(shù)脂更穩(wěn)定，Azadbakht等[48]和Mishig等[49]采用硅膠分別作為T(mén)LC和快速柱色譜的填料成功分離了秋水仙和蒙古蕕的生物堿。除了常見(jiàn)的大孔樹(shù)脂和硅膠外，羥丙基葡聚糖凝膠填料(Sephadex-20 LH)作為新型填料也進(jìn)入研究人員視線，它是以分子篩作用力為主、兼具分配作用機(jī)制、分離效率良好的填料，可在化合物分離后期使用。例如，Xiu等[50]采用乙醇粗提馬齒莧生物堿，然后運(yùn)用正-反相硅膠柱色譜分離，再采用Sephadex-20 LH柱色譜進(jìn)行分離得到了一種具有抗乙酰膽堿酯酶的新生物堿。表3列舉了采用新型工藝制備生物堿的研究。

表3 生物堿的新型制備工藝

2.3 揮發(fā)油

揮發(fā)油也被稱(chēng)作精油，是具有揮發(fā)性芳香氣味的物質(zhì)，以萜類(lèi)為主，包括單帖、倍半萜以及含氧衍生物。飼用上關(guān)注較多有牛至精油、大蒜精油、桉樹(shù)精油、沙蔥精油、艾葉精油、肉桂精油等。傳統(tǒng)的制備方法是水蒸餾法，但產(chǎn)量較低[58]。UAE、MAE和EAE的應(yīng)用有效提高了揮發(fā)油萃取效率。目前研究最多的是SCE[59]，其不使用易爆或有毒溶劑，無(wú)毒性殘留物、產(chǎn)物得率高、芳香族化合物保留率較好，適合分離植物精油[60]。Wang等[60]應(yīng)用優(yōu)化的SCE使莎草精油得率達(dá)到1.82%，是傳統(tǒng)提取方法的3倍多。但是，尹浩等[61]用3種方法酶輔助溶劑萃取法(4 h)、酶輔助水蒸氣蒸餾法(4 h)和SCE(30 min)提取油樟葉精油，結(jié)果顯示，SCE工藝效率雖高，但產(chǎn)物得率和抑菌活性均次于MAE和水蒸氣蒸餾法。這說(shuō)明對(duì)于SCE的應(yīng)用仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化。

揮發(fā)油組成較為復(fù)雜，直接采用色譜分離純化很難獲得單一成分。因此，揮發(fā)油一般需要經(jīng)過(guò)MD初步分離后，再進(jìn)行色譜分離[62]。MD是新型的液蒸餾技術(shù)，適用熱敏性化合物的分離，可與SCE聯(lián)合用于揮發(fā)油等組分的提取分離[15]。隨后，可采用GS-MS對(duì)揮發(fā)油進(jìn)一步分離鑒定。Marques等[20，63]用HSCCC分別從胡椒葉和紅葉果的水蒸餾產(chǎn)物中成功分離了4種和3種揮發(fā)油組分，純度均高于90%，用時(shí)低于2 h。進(jìn)而，Wang等[64]建立了離線DPPH-GC-MS-HSCCC流程，先用DPPH和GC-MS篩選抗氧化活性強(qiáng)的溫郁金精油，后采用HSCCC進(jìn)行分離，這是一套高效的精油篩選、鑒定和分離方法，具有分離分辨率高、檢測(cè)靈敏度高、結(jié)構(gòu)鑒定容易，目標(biāo)化合物可以定向分離?？傊?，揮發(fā)油的提取、分離和純化界限往往并不明顯，SCE同時(shí)兼有提取和純化的能力，但SCE的維持成本較高，目前還處于實(shí)驗(yàn)室小試階段，對(duì)于飼用天然植物揮發(fā)油的制備仍是巨大挑戰(zhàn)。表4列舉了采用新工藝的研究進(jìn)展。

表4 揮發(fā)油的新型制備工藝

2.4 植物多糖

植物多糖是由多個(gè)單糖以糖苷鍵形式連接起來(lái)的大分子活性物質(zhì)。目前，沙蒿多糖、茯苓多糖、馬齒莧多糖、當(dāng)歸多糖、黃芪多糖、苜蓿多糖、枸杞多糖等已在畜禽上開(kāi)展了飼喂效果評(píng)價(jià)，證明植物多糖具備抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，可作為新型飼料添加劑[70]。植物多糖的研究較多，因而提取工藝也更成熟，應(yīng)用最廣泛的方法是水提醇沉法，其利用多糖的羥基與水易形成氫鍵、而不易與醇類(lèi)形成氫鍵的特點(diǎn)，加入乙醇即可使多糖沉淀，缺點(diǎn)是容易造成了有效成分的大量流失。另一種傳統(tǒng)的制備方法是熱水提取，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溫度高等缺點(diǎn)。Ying等[71]比較了3種方法即CSE、MAE和UAE提取桑葉多糖的效果，發(fā)現(xiàn)UAE優(yōu)化條件的得率較高，這表明了UAE在制備多糖上的優(yōu)勢(shì)。也有報(bào)道稱(chēng)，MAE制備可能導(dǎo)致部分多糖降解，因此使用MAE時(shí)，微波功率和時(shí)間需要進(jìn)一步優(yōu)化[72]。Dong等[73]則檢驗(yàn)了MAE-UAE聯(lián)合提取方法，產(chǎn)物枸杞多糖的抗氧化活性比傳統(tǒng)方法更高，體現(xiàn)了方法組合的提取優(yōu)勢(shì)。但是，也有報(bào)道稱(chēng)，EAE同樣可以用于植物多糖的提取，如Wang等[74]組合纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，優(yōu)化提取條件，使苜蓿多糖得率達(dá)到5.05%。但EAE很少單獨(dú)使用，通常與其他提取方法組合使用，以提高多糖的得率。

植物多糖的分離純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。粗多糖的提取液往往與蛋白質(zhì)、色素、無(wú)機(jī)小分子等雜質(zhì)混在一起，需要將這些雜質(zhì)去除，以免影響多糖的質(zhì)量和純度及后續(xù)結(jié)構(gòu)表征的可靠性。在眾多植物多糖的純化方法中，常用的是Sevag法、MARC、GPC和IEC等[75]。Sevag法利用氯仿-正丁醇溶液可以將游離蛋白變性成為不溶性物質(zhì)，從而過(guò)濾蛋白，是多糖制備除蛋白最有效的方法，應(yīng)用最為普遍[17,76]。除蛋白之后，一般需要再經(jīng)CC進(jìn)一步純化。種分離純化色譜柱組合使用可以取得更好的效果。Fan等[18]對(duì)藜麥種子多糖粗提物進(jìn)行Sevag法除蛋白，然后使用離子交換柱DEAE-52 Cellulose洗脫，洗脫液裝載到凝膠柱Sephadex G-50，進(jìn)一步純化得到7種多糖。基于文獻(xiàn)總結(jié)，植物多糖分離純化常用的離子交換色譜柱包括DEAE-Cellulose、DEAE-Cellulose 52、DEAE-Sepharose CL-6B和DEAE-Sepharose FF等，凝膠滲透色譜柱有Sephadex G、Sephacryl S和Sepharose CL[77]。植物多糖分離純化方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，但如何選擇最佳的色譜柱和純化條件優(yōu)化仍鮮有報(bào)道，針對(duì)種類(lèi)繁多的飼用植物多糖，分離純化工藝的進(jìn)一步優(yōu)化選擇是今后重點(diǎn)研究的方向。表5列舉了采用新工藝提取植物多糖的研究。

表5 植物多糖的新型制備工藝

2.5 苷類(lèi)

苷類(lèi)是糖或糖的衍生物與另一非糖物質(zhì)通過(guò)糖的端基碳原子連接而成的一類(lèi)化合物，又被稱(chēng)為配糖體。按化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，可以分為香豆素苷、蒽醌苷、皂苷、黃酮苷等。飼用上關(guān)注度最高的是皂苷，其可調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵，抑制甲烷排放。除了MAE和UAE外，新型綠色溶劑DES也普遍用于苷類(lèi)的制備，如Milani等[84]采用DES(氯化四甲銨+乙二醇)提取甜葉菊中的甜菊醇苷，輔以超聲萃取，試驗(yàn)結(jié)果表明，UAE+DES提取的甜菊糖苷是傳統(tǒng)溶劑的3倍，該研究證明了UAE+DES在提取苷類(lèi)化合物上的優(yōu)勢(shì)。目前，高速剪切均質(zhì)萃取(HSHE)和離子液體(IL)萃取是苷類(lèi)制備工藝的研究熱點(diǎn)。高速剪切技術(shù)是一種新型的均質(zhì)粉碎技術(shù)，已用于多種天然植物活性物質(zhì)的制備。Xu等[85]使用59%乙醇作為溶劑，采用HSHE提取甜葉菊中制備甜菊糖苷，證明HSHE的制備效率比MAE和UAE更高，這也為苷類(lèi)制備提出了一個(gè)新思路。IL具有不揮發(fā)或極低揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性好、溶解性強(qiáng)等特點(diǎn)，是新型的綠色溶劑。Ji等[86]研究證明，與傳統(tǒng)UAE相比，基于IL溶劑(1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽)的UAE(IL-UAE)對(duì)甘草微觀結(jié)構(gòu)的破壞更大，從而使得黃酮苷和三萜皂苷提取效率更高，且IL-UAE的提取時(shí)間短，液料比小。因此，IL作為綠色萃取溶劑在苷類(lèi)萃取上具有廣闊的應(yīng)用前景。

苷類(lèi)的分離純化方面，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最多的MARC、Pre-HPLC和HSCCC等。在提取苷類(lèi)成分時(shí)，親水成分如糖和單寧常成為粗提物中的雜質(zhì)。弱極性大孔樹(shù)脂吸附雜質(zhì)后，雜質(zhì)容易被水洗脫，然后用不同乙醇洗下吸附的苷類(lèi)，得到純度較高的目標(biāo)化合物，此方法在皂苷的分離中十分常用。根據(jù)許多文獻(xiàn)中皂苷制備的大孔樹(shù)脂吸附和解析特性，證明AB-8和D101型吸附量大、易解析且重復(fù)性能好，是分離苷類(lèi)化合物較為理想的樹(shù)脂類(lèi)型[87]。但是，在分離粗提物中多聚體與苷類(lèi)方面，CC還存在不足，而Pre-HPLC和HSCCC作為先進(jìn)的分離技術(shù)可以有效地實(shí)現(xiàn)兩者分離。李媛媛等[88]采用HSCCC，從紅葡萄皮中分離出3種花色苷，純度均高于95%。另外，MARC也可聯(lián)合Pre-HPLC或HSCCC制備分離苷類(lèi)。例如，Li等[89]制備荷葉青中的皂苷，先用D101樹(shù)脂純化，再用硅膠柱色譜洗脫，然后結(jié)合Pre-HPLC分離得到4種三萜皂苷。因此，優(yōu)化以MARC為代表的柱色譜與Pre-HPLC聯(lián)用，發(fā)揮各自特點(diǎn)，是苷類(lèi)化合物高效提取的關(guān)鍵。表6列舉了苷類(lèi)化合物的新型制備工藝。

表6 苷類(lèi)的新型制備工藝

2.6 有機(jī)酸

有機(jī)酸是存在于天然植物中的具有羧基的一類(lèi)有機(jī)化合物，如草酸、蘋(píng)果酸、苯甲酸、水楊酸、綠原酸、檸檬酸、富馬酸、阿魏酸、咖啡酸等。有機(jī)酸的酸性可以降低動(dòng)物腸道pH，抑制有害菌，有利于腸道有益菌生長(zhǎng)，從而促進(jìn)養(yǎng)分消化吸收，也被視作替代抗生素的新型飼料添加劑[97]。相較于其他功能組分，有機(jī)酸的制備工藝受到的關(guān)注度較低。飼用上關(guān)注度較高的阿魏酸主要采用酶法提取，Lau等[98]采用阿魏酸酯酶(0.02 U/g)和木聚糖酶(3 475.3 U/g)提取玉米穗富含的阿魏酸，產(chǎn)物得率達(dá)到了1.69 g/kg，提取效率明顯提高。封易成等[99]聯(lián)合應(yīng)用離子液體、酶解和超聲輔助(IL-EAE-UAE)并優(yōu)化條件提取山楂中檸檬酸，與水浸提法比較，2種方法提取到的檸檬酸含量接近，但前者提取時(shí)間是25.3 min，遠(yuǎn)低于后者的4 h?？梢?jiàn)，UAE與EAE組合運(yùn)用可加強(qiáng)對(duì)植物細(xì)胞壁的破壞，釋放更多有機(jī)酸，兩者在協(xié)同萃取有機(jī)酸上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

有機(jī)酸分離純化方面，以MARC、Pre-HPLC、HSCCC和pH區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)等方法為主。胡居吾等[100]聯(lián)用大孔樹(shù)脂306與GPC，進(jìn)而使用Pre-HPLC對(duì)蔓三七葉中的綠原酸和異綠原酸進(jìn)行分離制備，兩者純度均達(dá)到96%以上，具有良好的自由基清除作用。HSCCC的制備工藝也在不斷得到優(yōu)化，如溶劑體系的改良。張偉等[101]將離子液體[C6min][PF6]作為HSCCC兩相溶劑體系的改良劑，分離制備金銀花提取物中的綠原酸，純度為97.5%。pH-zone-refining CCC是近年來(lái)在傳統(tǒng)逆流色譜上發(fā)展起來(lái)特殊逆流色譜分配技術(shù)，根據(jù)化合物的解離常數(shù)和疏水性質(zhì)差異而實(shí)現(xiàn)分離，上樣量是傳統(tǒng)HSCCC的十幾倍，且目標(biāo)產(chǎn)物純度更高，非常適合生物堿和有機(jī)酸的制備[102]。Tang等[102]為制備分離麥麩中阿魏酸的2種立體異構(gòu)體，采用了兩步分離措施，先使用HSCCC(己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=2∶5∶2∶4)，再運(yùn)用pH-zone-refining CCC(己烷-乙酸乙酯-乙腈-水= 2∶5∶2∶2)得到反式-阿魏酸和順式-阿魏酸的純度分別為99%和98%，說(shuō)明了pH-zone-refining CCC分離制備有機(jī)酸上的高純度優(yōu)勢(shì)。表7列舉了采用新工藝制備有機(jī)酸的研究進(jìn)展。

表7 有機(jī)酸的新型制備工藝

3 植物活性功能組分制備研究存在的問(wèn)題與展望

盧德勛[108]于2004年首次提出了飼料營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)組學(xué)理論，強(qiáng)調(diào)多種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)組合和整體功能，產(chǎn)品應(yīng)用應(yīng)融入動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)工程技術(shù)體系，這為活性功能組分產(chǎn)品研發(fā)提供了理論指導(dǎo)。當(dāng)前，雖然涌現(xiàn)了以微波、超聲、酶、超臨界流體等為代表的新型輔助萃取手段，以及以柱色譜、Pre-HPLC和HSCCC等新型分離純化方法，但方法學(xué)研究也存在諸多問(wèn)題。1)制備工藝的研究大多只關(guān)注某植物中的一種(類(lèi))活性功能組分，多種植物活性功能組分在動(dòng)物體內(nèi)代謝可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)提高生物活性和生物利用度，因此對(duì)于單一組分追求太高純度，則可能造成制備成本提高。2)制備工藝優(yōu)化的條件不一，即使同是MAE和UAE，但選擇的優(yōu)化參數(shù)不同，導(dǎo)致大量研究無(wú)法進(jìn)行比較和歸納；研究結(jié)果更注重產(chǎn)物的得率，而對(duì)制備過(guò)程中植物活性功能組分的分子結(jié)構(gòu)損害程度缺乏關(guān)注，而這直接關(guān)系到制備后物質(zhì)的生物活性。3)研究文獻(xiàn)多基于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)是在小試條件下優(yōu)化的，優(yōu)化的工藝參數(shù)與工廠化差距大，甚至不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

對(duì)此，適合畜禽生產(chǎn)的天然植物活性功能組分制備工藝體系亟待建立。1)應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化工藝，吸納各種組分制備的特點(diǎn)，建立并優(yōu)化同時(shí)提取多種組分的工藝，分離純化后要結(jié)合結(jié)構(gòu)解析和體外體內(nèi)試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)多組分提取物的相互作用，確定適宜的純度，最大化地利用天然植物的價(jià)值。2)建立制備工藝優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)體系，明確MAE、UAE、EAE、IL、SCE等獨(dú)立或聯(lián)合應(yīng)用應(yīng)優(yōu)化的條件，針對(duì)不同植物及不同目標(biāo)化合物，建立一套優(yōu)化參數(shù)值的參考范圍。制備工藝研究不僅要關(guān)注產(chǎn)物的得率，也要注重植物材料的來(lái)源和標(biāo)準(zhǔn)化，采用光譜等檢測(cè)手段，評(píng)估產(chǎn)物的降解或結(jié)構(gòu)受損情況。3)以市場(chǎng)化為導(dǎo)向，聯(lián)合畜牧企業(yè)開(kāi)展調(diào)研，可選定某一類(lèi)植物或某一類(lèi)活性功能組分作為突破口，建立適合工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制參數(shù)，廣泛開(kāi)展中試試驗(yàn)，降低制備成本。此外，組分制備應(yīng)充分認(rèn)識(shí)到產(chǎn)品融入飼用技術(shù)體系的必要性，考慮活性功能組分與飼糧營(yíng)養(yǎng)成分的相互作用、動(dòng)物不同生理階段、不同飼養(yǎng)決策目標(biāo)和環(huán)境因素等，以使活性物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)效果。

4 小 結(jié)

天然植物是一個(gè)十分復(fù)雜的體系，從繁多的植物中提取和分離各種活性功能組分，是促進(jìn)天然植物活性功能組分飼用化必須要解決的課題。本文總結(jié)了植物各活性功能組分的主要制備方法，重點(diǎn)介紹了具有飼用潛力的六大活性組分制備研究進(jìn)展。未來(lái)，應(yīng)重點(diǎn)推進(jìn)綠色制備工藝優(yōu)化，加強(qiáng)方法的聯(lián)用，強(qiáng)調(diào)制備效率，提高目標(biāo)化合物得率和純度。針對(duì)畜牧業(yè)特點(diǎn)，建立從植物篩選到組分制備，再到體內(nèi)、體外試驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)室研究到工廠化生產(chǎn)的研發(fā)流程，以不斷開(kāi)發(fā)低成本、環(huán)境友好且利于動(dòng)物生長(zhǎng)和健康的植物活性功能組分產(chǎn)品。