丁 軒，劉建蕊，楊青青，冉 麗，鄭姚佩，田 羽，韋永琴，劉維芳，李 祝

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

糠醛(Furfural)是一種重要的生物質(zhì)平臺化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有呋喃環(huán)和醛基，化學(xué)性質(zhì)活潑，可作為多種化學(xué)產(chǎn)品的起始原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、化工、能源等領(lǐng)域。張素等、趙妗頤等試驗發(fā)現(xiàn)黑曲霉xj菌株粗提物中對齊整小核菌和鏈格孢菌具有拮抗作用的物質(zhì)可能是糠醛，說明糠醛可能具有抑菌作用。目前生產(chǎn)糠醛主要是酸水解法，戊糖經(jīng)酸催化環(huán)化脫水形成，而大多含有戊糖的物質(zhì)都可作為原材料生產(chǎn)糠醛。五-羥甲基糠醛(5-Hydorxymethylfurfural，簡寫為5-HMF)，因其具有呋喃環(huán)、醛基及羥基，所以穩(wěn)定性差、性質(zhì)活潑，是一種重要的平臺化學(xué)物。可通過縮合反應(yīng)、氧化反應(yīng)、氫化反應(yīng)和縮醛等反應(yīng)，合成多種具有高附加價值的衍生物如2,5-二呋喃甲醛(DFF)、五-?；匪?HMFCA)等。5-HMF的眾多衍生物可作為有機(jī)導(dǎo)體、生物燃料，在醫(yī)藥方面具有抗癌細(xì)胞增值活性，降血糖等藥理作用。馬明超等展示了許多制備5-HMF的方法，其中葡萄糖轉(zhuǎn)化制備 5-HMF的方法達(dá)到72%的產(chǎn)率。雖然目前生產(chǎn)糠醛和5-HMF的方法眾多，但仍存在產(chǎn)率較低、生產(chǎn)資源浪費等情況。

黑曲霉()屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是絲狀真菌中一個常見真菌。具有生長旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素等特點，屬于GRAS菌種，是應(yīng)用于食品工業(yè)上發(fā)酵和生產(chǎn)酶制劑的主要菌種。黑曲霉的基因組中發(fā)現(xiàn)了大量與次級代謝有關(guān)的基因簇，可以產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，關(guān)麗萍等在海洋真菌2HL-M -8的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)11個黑曲霉的次級代謝產(chǎn)物。因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中，其中黑曲霉已被用于規(guī)?；罅堪l(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。

目前提高次級代謝產(chǎn)量的方法主要有菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、微生物共培養(yǎng)。誘變選育菌株包含化學(xué)誘變、物理誘變以及復(fù)合誘變。在誘變選育中常使用2種以上的誘變方法復(fù)合誘變提高誘變效應(yīng)；發(fā)酵優(yōu)化為發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和培養(yǎng)條件的優(yōu)化；而微生物共培養(yǎng)發(fā)酵可以使活性粗提取物增加、促進(jìn)次級代謝產(chǎn)量的提高以及誘導(dǎo)新的次級代謝物的合成，還可誘發(fā)原次級代謝物的類似物的共同途徑。除以上三種提高次級代謝產(chǎn)物的方法外，目前誘導(dǎo)子也廣泛應(yīng)用于提高次級代謝產(chǎn)量。

誘導(dǎo)子(Elicitor)最初定義為可誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生和積累植保素的化學(xué)物質(zhì)，但隨著誘導(dǎo)子的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子是一類可以特異激活植物或微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)。目前誘導(dǎo)子已廣泛應(yīng)用于提高植物中次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量且誘導(dǎo)機(jī)制較成熟透徹。而誘導(dǎo)子在微生物方面的應(yīng)用主要是關(guān)于促進(jìn)納他霉素的產(chǎn)量，試驗發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子和黑曲霉代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子對產(chǎn)納他霉具有較好的促進(jìn)作用。目前將誘導(dǎo)子用于提高黑曲霉次級代謝產(chǎn)量的研究很少見，本試驗主要利用誘導(dǎo)子來提高黑曲霉產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物—糠醛和5-HMF的產(chǎn)量，以便為后續(xù)的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糠醛和5-HMF提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試驗菌種

黑曲霉()xj,由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，現(xiàn)于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存(CCTCC No：M206021)。

培養(yǎng)基及試劑

馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)；馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)；LB培養(yǎng)基；0.1%吐溫-80溶液。

1.2 試驗方法

誘導(dǎo)子的制備

1.2.1.1 誘導(dǎo)子類型

本次試驗以10種生物誘導(dǎo)子(表1)和6種非生物誘導(dǎo)子CuSO、苯甲酸鈉、氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸為篩選目標(biāo)。

表1 生物誘導(dǎo)子的類型

1.2.1.2 非生物誘導(dǎo)子的制備

參考聶麗的試驗方法，將上述非生物誘導(dǎo)子配成濃度為10 μg/mL的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜后得到的溶液即為非生物誘導(dǎo)子。

1.2.1.3 生物誘導(dǎo)子的制備

采用凍融研磨法制備生物誘導(dǎo)子。除微生物的培養(yǎng)方式不同外，其余步驟與聶麗相同，改動如下。

真菌誘導(dǎo)子:用打孔器分別將鏈格孢菌()、煙草疫霉()、齊整小核菌()制成菌餅后，分別接種到PDB 培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)中，于28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)7 d，其中齊整小核菌28 ℃靜止培養(yǎng)7 d，過濾收集菌體。將收集的菌體參照聶麗的凍融研磨法制備誘導(dǎo)子，后置于4 ℃冰箱中備用。

細(xì)菌誘導(dǎo)子:分別將青枯雷爾氏菌()、根癌農(nóng)桿菌()、巨大芽孢桿菌()、胡蘿卜軟腐歐文氏菌()接種到LB培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)中30 ℃，150 r/min培養(yǎng)2 d；大腸桿菌()、枯草芽孢桿菌()、金黃色葡萄球菌()接種到LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，10000 r/min離心10 min 收集菌體。收集到的菌體同真菌誘導(dǎo)子制備方法一致。

1.2.1.4 生物誘導(dǎo)子還原糖含量的測定

以還原糖含量作為生物誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度的指標(biāo)，采用3,5 一二硝基水楊酸(DNS)比色法測定其還原糖含量。參照趙凱等試驗利用DNS比色法測定還原糖濃度，選取DNS試劑2在波長為550 nm處測定。

黑曲霉種子液的生長曲線

將活化的黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基中，于26 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，用適量的0.1%吐溫-80無菌溶液洗下孢子。參照袁洪威等的試驗方法用分光光度計測定黑曲霉孢子懸浮液濃度。制備濃度為10CFU/mL孢子懸浮液，以6%的接種量加入種子培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中。培養(yǎng)8 d，每24 h取樣測定菌體干重。

發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

1.2.3.1 建立糠醛和5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線模型

試驗方法參照彭秋菊等和張素等用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中五-羥甲基糠醛和糠醛的含量，建立糠醛和5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

參照彭秋菊等和張素等用HPLC法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛和5-HMF的含量。稍有改動，改動如下：將斜面培養(yǎng)基中的黑曲霉活化，制成10CFU/mL孢子懸浮液，將孢子懸液以8%～12%(V/V)接種于發(fā)酵瓶中培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液處理方法以及色譜條件與彭秋菊等試驗一致。

誘導(dǎo)子篩選及優(yōu)化

主要以發(fā)酵液中糠醛含量為評價指標(biāo)，將處于對數(shù)生長末期的種子液按6%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗設(shè)計。

1.2.4.1 誘導(dǎo)子種類及最佳添加時間的篩選

將濃度為10 μg/mL的氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸和濃度為10 μmol/mL的CuSO和苯甲酸鈉，還原糖濃度為10 μg/mL的生物誘導(dǎo)子以1%的添加量，在誘導(dǎo)時間為72 h的條件下，添加時間設(shè)為0 d、3 d、5 d，測糠醛和5-HMF的含量。以糠醛含量為指標(biāo)，篩選最佳誘導(dǎo)子及最佳添加時間。以不添加誘導(dǎo)子為空白對照。

1.2.4.2 誘導(dǎo)子添加量的篩選

在誘導(dǎo)子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導(dǎo)時間為72 h的條件下，添加量設(shè)為1%、2%、4%、6%、8%、10%，測糠醛和5-HMF含量。

1.2.4.3 誘導(dǎo)子誘導(dǎo)時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導(dǎo)時間設(shè)為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,測糠醛和5-HMF含量(誘導(dǎo)時間從誘導(dǎo)子加入后開始計算，而發(fā)酵時間針對空白對照，包含添加時間)。

響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取最佳條件作為0因素水平，設(shè)計三因素三水平的Box-Behnken試驗(表2)。利用Design-Expert軟件設(shè)計Box-Behnken試驗方案，以黑曲霉發(fā)酵液中的糠醛產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析，預(yù)測誘導(dǎo)子在黑曲霉發(fā)酵體系中的最佳誘導(dǎo)條件。(因為最佳添加時間為0 d，左邊已是極值，故選用1d為0水平)

表2 Box-Behnken試驗因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用DNS法測定還原糖濃度(即生物誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度)。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為=04957-00088(=0.998)，葡萄糖含量在0～1.2 mg之間，具有良好線性關(guān)系。

2.2 黑曲霉在種子培養(yǎng)基中的的生長曲線

將濃度為10CFU/mL孢子懸浮液以6%的接種量接入種子培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL。由圖1可知，經(jīng)過3 d培養(yǎng)后菌種生物量最大，即將進(jìn)入穩(wěn)定期，可將對數(shù)生長期末期(3 d)的培養(yǎng)液作為種子液，進(jìn)行發(fā)酵試驗。

圖1 黑曲霉種子液生長曲線Fig.1 Growth curve of A. niger seed solution

2.3 糠醛和五羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用HPLC法測定糠醛和5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為=57582+19582(=0.999)。5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為=72107-11357(=0.999)。兩個方程在0～60 μg/mL濃度范圍具有良好線性關(guān)系。

2.4 誘導(dǎo)子種類及誘導(dǎo)時間篩選

分別向已培養(yǎng)0 d、3 d、5 d的發(fā)酵培養(yǎng)液中添加10種生物誘導(dǎo)子及6種非生物誘導(dǎo)子。其中非生物誘導(dǎo)子對于黑曲霉的作用效果不明顯，但生物誘導(dǎo)子有較明顯的作用效果。綜合圖2-4來看，相比于CK培養(yǎng)基液中的糠醛產(chǎn)量，0 d添加的ATFE、SAE、AAE、PNE具有促進(jìn)作用。其中SAE的誘導(dǎo)效果最佳，其余誘導(dǎo)子對糠醛產(chǎn)量均表現(xiàn)為抑制作用,其中PNE對菌體的生長也具有抑制作用；在3 d時添加誘導(dǎo)子均表現(xiàn)為促進(jìn)作用；在5 d時添加誘導(dǎo)子較0 d糠醛的產(chǎn)量減少?？芍? d添加SAE效果顯著優(yōu)越，糠醛含量達(dá)47.44 μg/mL，較空白對照(CK)提升了19.18 μg/mL；5-HMF含量達(dá)38.59 μg/mL，較空白對照提高了16.50 μg/mL。故選擇最佳誘導(dǎo)子為SAE，最佳添加時間為0 d。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著，下同。圖2 0 d添加誘導(dǎo)子時不同誘導(dǎo)子對黑曲霉產(chǎn)生糠醛和5-HMF的影響Fig .2 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on 0 day

圖3 3 d添加誘導(dǎo)子時不同誘導(dǎo)子對對黑曲霉產(chǎn)生糠醛和5-HMF的影響Fig.3 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on the third day

圖4 5 d添加誘導(dǎo)子時不同誘導(dǎo)子對對黑曲霉產(chǎn)生糠醛和5-HMF的影響Fig.4 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on the fifth day

2.5 誘導(dǎo)子最佳添加量的篩選

在誘導(dǎo)子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導(dǎo)時間為72 h的條件下，添加量按1%、2%、4%、6%、8%、10%與黑曲霉種子液一起加入發(fā)酵液中，測定糠醛和5-HMF的含量。由圖5可知，1%的添加量產(chǎn)生糠醛含量較高，其余濃度對產(chǎn)糠醛影響不大，故選取1%為最佳添加量。

圖5 添加不同濃度的誘導(dǎo)子對黑曲霉產(chǎn)生糠醛影響Fig.5 Effects of adding different concentrations of elicitors on furfural production by A. niger

2.6 誘導(dǎo)子最佳誘導(dǎo)時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h(從加入誘導(dǎo)子時間開始計算)。由圖6可知，誘導(dǎo)子時間為12 h對促進(jìn)黑曲霉產(chǎn)生糠醛含量最大達(dá)到53.22 μg/mL；5-HMF含量達(dá)42.46 μg/mL。故最佳誘導(dǎo)時間為12 h。

圖6 不同誘導(dǎo)時間對黑曲霉產(chǎn)生糠醛影響Fig.6 Effect of different induction times on furfural production of A. niger

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化誘導(dǎo)條件

響應(yīng)面的模型建立與統(tǒng)計分析

確定單因素的最佳值后，進(jìn)行Box-Behnken試驗，以發(fā)酵液中的糠醛(Y)的產(chǎn)量為響應(yīng)值,誘導(dǎo)子的添加時間(A)、添加量(B)以及誘導(dǎo)時間(C)為變量，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)

根據(jù)表3的試驗結(jié)果，利用Design Expert 8對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到糠醛的回歸方程：Y=42.71-13.2A-0.15B-1.09C+0.47AB+1.01AC+0.59BC-5.66A-1.02B-7.73C。

表4 糠醛的回歸方程分析結(jié)果

響應(yīng)面分析及優(yōu)化

利用Design Expert根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，尋找糠醛產(chǎn)量最大的誘導(dǎo)條件。響應(yīng)面的陡峭程度可以表明變量對因變量的影響程度，響應(yīng)面越陡峭說明相關(guān)因素影響效果越明顯。由圖7可知，三個因素對黑曲霉產(chǎn)糠醛的影響表現(xiàn)為：添加時間(A)>誘導(dǎo)時間(C)>添加量(B)。對模型進(jìn)行分析，得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件：添加時間為0 d、添加量為0.675%、誘導(dǎo)時間為8.6 h，此條件下的糠醛含量理論值為50.52 μg/mL。根據(jù)給出的最佳培養(yǎng)條件設(shè)計試驗進(jìn)行驗證(設(shè)置三組平行試驗)得出發(fā)酵液中糠醛的實際含量分別為50.51、50.47、50.48 μg/mL，與預(yù)測值較為接近，說明此模型可以較好地預(yù)測誘導(dǎo)條件下的糠醛產(chǎn)量。而在糠醛的最佳誘導(dǎo)條件下發(fā)酵液中5-HMF的實際產(chǎn)量也達(dá)到了41.12 μg/mL。

圖7 糠醛添加時間與添加量、添加時間與誘導(dǎo)時間及添加量與誘導(dǎo)時間的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 The response surface and contour map about furfural addition time and amount,addition time and induction time,and addition amount and induction time

3 結(jié)論與討論

用誘導(dǎo)子提高微生物次級代謝的產(chǎn)量，不僅與黑曲霉自身的發(fā)酵特性有關(guān)，還跟誘導(dǎo)子的種類、誘導(dǎo)子的含量、添加時間和誘導(dǎo)時間有密切的關(guān)系。聶麗等試驗表明細(xì)菌誘導(dǎo)子內(nèi)的活性成分主要是多糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，并且在誘導(dǎo)鏈霉菌合成農(nóng)抗702時也是細(xì)菌誘導(dǎo)子具有較好的誘導(dǎo)效果。結(jié)果顯示，對黑曲霉發(fā)酵作用最好的誘導(dǎo)子為金葡萄球菌代謝產(chǎn)物，是一種細(xì)菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子，說明細(xì)菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子對微生物產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有一定的作用效果，但對于SAE內(nèi)的具體有效物質(zhì)還是未知的。在確定最佳誘導(dǎo)子后，觀察誘導(dǎo)子的含量、添加時間和誘導(dǎo)時間對其誘導(dǎo)效果的影響。本試驗在添加濃度為1%時產(chǎn)糠醛量最大，但隨著誘導(dǎo)子的含量增加，出現(xiàn)產(chǎn)糠醛含量較高的添加量。有人將誘導(dǎo)子含量與次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的關(guān)系概括為飽和型和最適型，最適型可以解釋本試驗的情況。本試驗的最佳添加時間是將種子液與金葡萄球菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基，即為0 d，表明在對數(shù)生長期末期時加入誘導(dǎo)子，次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較多。在邊猛試驗中利用sp.代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子作用于海洋真菌，結(jié)果表明將真菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期加入誘導(dǎo)子，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量最高，這與本試驗的結(jié)果一致。關(guān)于誘導(dǎo)子最佳添加時間出現(xiàn)的情況，可能是由于在真菌培養(yǎng)早期合成糠醛和5-HMF的關(guān)鍵酶前體物質(zhì)不足，導(dǎo)致早期加入誘導(dǎo)子無法激活關(guān)鍵酶的活性，而在對數(shù)生長期末期關(guān)鍵酶前體物質(zhì)充足，受到誘導(dǎo)子的刺激導(dǎo)致關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)，次生代謝產(chǎn)物含量增多。對于不同的誘導(dǎo)時間，在12～48 h內(nèi)誘導(dǎo)子具有明顯的促進(jìn)效應(yīng)，說明在發(fā)酵初期誘導(dǎo)子的作用效果較明顯。但是隨著誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)時間推移，糠醛產(chǎn)量降低，誘導(dǎo)子的作用效果不顯著。而在64 h后出現(xiàn)空白對照的含量高于樣品組，可能是由于前期發(fā)酵大量消耗了培養(yǎng)基中的成分，導(dǎo)致添加誘導(dǎo)子的樣品后期次生代謝產(chǎn)物較空白組少。

響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化發(fā)酵條件具有優(yōu)化速度快，預(yù)測結(jié)果偏差小等優(yōu)點。目前，已有報道將響應(yīng)面優(yōu)化法應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化以及誘導(dǎo)子篩選等方面。如彭秋菊等用響應(yīng)面優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)基條件較優(yōu)化前糠醛產(chǎn)量提高了20.2%；魏寶東等利用響應(yīng)面法優(yōu)化促進(jìn)納他霉素合成的誘導(dǎo)子誘導(dǎo)條件，經(jīng)優(yōu)化后納他霉素產(chǎn)量提高了1.68倍。以上試驗說明響應(yīng)面優(yōu)化法對于發(fā)酵具有較好的優(yōu)化效果。本試驗利用經(jīng)單因素試驗確定了誘導(dǎo)子的種類、誘導(dǎo)子添加時間、誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時間的范圍后，利用Box-Behnken試驗并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化篩選出黑曲霉產(chǎn)糠醛最佳條件為：糠醛的添加時間為0 d、添加量0.675%，誘導(dǎo)時間8.6 h。在此條件下培養(yǎng)黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量為50.49 μg/mL，較空白對照(36.84 μg/mL)提高了37%；5-HMF的含量為41.12 μg/mL，較空白對照(32.08 μg/mL)提高了31%。