楊 莎，蔡仁蓮,，陳緒美，趙 帥，田 瑩，郭建軍*

(1.貴州大學(xué) 昆蟲(chóng)研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563000)

肝癌作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。統(tǒng)計(jì)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例與死亡病例分別為905 677與830 180例，且死亡率超過(guò)胃癌，從2018年的第三順位提升至2020年的第二順位；在中國(guó)，肝癌的形勢(shì)則更加嚴(yán)峻，2020年發(fā)病率與死亡率接近世界平均水平的兩倍。目前肝癌的西醫(yī)療法主要有手術(shù)切除、動(dòng)脈介入、放射療法等，但面臨復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，并伴隨著一系列副作用；傳統(tǒng)中醫(yī)具有防癌變、抑惡化、促修復(fù)等作用，常成為癌癥治療的有效補(bǔ)充。

九香蟲(chóng)(Dallas,1851)隸屬于昆蟲(chóng)綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae，為民間常見(jiàn)蟲(chóng)類(lèi)中藥，具有理氣止痛、溫中助陽(yáng)的功效。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，九香蟲(chóng)抗癌、抗菌、抗凝血等功能逐漸得以研究。研究表明，九香蟲(chóng)具有抗乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等作用。在傳統(tǒng)中藥復(fù)方中，九香蟲(chóng)常與其他藥物配伍使用，且水煎液為常用的給藥方式，但對(duì)其水煎液?jiǎn)为?dú)作用于癌癥的研究較少，僅見(jiàn)田瑩等對(duì)乳腺癌的研究報(bào)道，對(duì)九香蟲(chóng)水煎液作用于肝癌的研究更是鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)，研究了九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2體外生長(zhǎng)作用的影響，以期為九香蟲(chóng)水煎液在肝癌的臨床應(yīng)用上奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為九香蟲(chóng)藥用價(jià)值的深層次開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

生物材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；九香蟲(chóng)成蟲(chóng)采集于貴州凱里市黃平縣重安鎮(zhèn)(E 107.80°，N 26.52°)。

試驗(yàn)試劑

含1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Amresco公司)、Hoechst 33258染料(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒-MDC法(北京索萊寶科技有限公司)。

試驗(yàn)儀器

0.22 μm針管式過(guò)濾器(美國(guó)Millipore公司)、超低溫冰箱(浙江捷盛制冷科技有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(西班牙Telstar公司)、離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、倒置相差顯微鏡(廈門(mén)麥克奧迪公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

九香蟲(chóng)水煎液的制備

-80 ℃冰箱取出九香蟲(chóng)成蟲(chóng)，純水沖洗兩遍，烘干研磨成粉，取50 g蟲(chóng)粉加入100 mL純水，浸泡30 min后于砂鍋中煎煮60 min，小火濃縮至1 g/mL的九香蟲(chóng)水煎液。所得液體先后經(jīng)紗布與濾紙過(guò)濾，6000×g、10 min離心2次，吸取上清于生物安全柜經(jīng)0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌，用1.5 mL無(wú)菌離心管分裝并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清與1%青霉素、鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。

形態(tài)學(xué)觀(guān)察及MTT法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化處理，接種于96孔培養(yǎng)板(1×10個(gè)/孔)。設(shè)置空白組(未接種細(xì)胞)、對(duì)照組(未加藥物)以及試驗(yàn)組(10、20、30、40 mg/mL)共6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)至孔底總面積的80%～90%后，棄掉培養(yǎng)液，空白組與對(duì)照組每孔加入100 μL MEM培養(yǎng)基，試驗(yàn)組分別加入不同九香蟲(chóng)水煎液濃度的培養(yǎng)液100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)并拍照記錄。拍照后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g/L)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上10 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力(%)=(試驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響

采用MDC法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，消化細(xì)胞接種于24孔板(2×10個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔按1.2.3加入相同濃度含九香蟲(chóng)水煎液的培養(yǎng)液500 μL，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，加入10 μL MDC染液，37 ℃避光染色30 min，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的影響

采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，細(xì)胞處理同1.2.4。加藥培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入300 μL甲醇固定30 min，棄甲醇，加入100 μL Hoechst 33258染液37 ℃避光染色15 min，PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以Mean±SEM表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以<005為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察及MTT法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響

不同濃度九香蟲(chóng)水煎液作用于HepG2細(xì)胞24 h后，對(duì)照組的細(xì)胞飽滿(mǎn)圓潤(rùn)，輪廓清晰，貼壁性良好且細(xì)胞分布致密，無(wú)細(xì)胞碎片產(chǎn)生(圖1-a)，而試驗(yàn)組(圖1-b～e)則出現(xiàn)不同程度細(xì)胞皺縮，細(xì)胞碎片，細(xì)胞漂浮以及分布稀疏的現(xiàn)象，且隨著濃度的增加，細(xì)胞皺縮、漂浮與細(xì)胞碎片數(shù)量增多，當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)幾乎無(wú)貼壁細(xì)胞(圖1-e)。

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。隨著九香蟲(chóng)水煎液濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低(<001)，表明九香蟲(chóng)水煎液具有顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，且呈濃度依賴(lài)性(圖2)。九香蟲(chóng)水煎液作用于肝癌HepG2細(xì)胞24 h的半抑制濃度(IC)為26.23 mg/mL。

注：a-e分別為0、10、20、30、40 mg/mL，下同。圖1 九香蟲(chóng)水煎液作用24 h對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(100x)Fig.1 Effect of A.chinensis decoction on the morphology of HepG2 cells for 24 h (100x)

注：“*”表示P<0.05；“***”表示P<0.001。圖2 九香蟲(chóng)水煎液作用24 h對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of A.chinensis decoction on the proliferation of HepG2 cells for 24 h

2.2 九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞自噬作用的影響

MDC染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的黃綠色熒光，試驗(yàn)組則熒光強(qiáng)度增加，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核碎裂呈大小不一的點(diǎn)狀，被染成致密的藍(lán)綠色顆粒(圖3)。隨著九香蟲(chóng)水煎液濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核碎片增加，表明九香蟲(chóng)水煎液促進(jìn)HepG2細(xì)胞自噬體形成。

圖3 MDC法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞自噬的影響(200 x)Fig.3 Effect of A.chinensis decoction on the autophagy of HepG2 cells for 24 h detected by MDC method (200 x)

2.3 九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用的影響

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照組呈彌散均勻熒光(圖4-a)，低濃度九香蟲(chóng)水煎液(圖4-b、c)作用下細(xì)胞出現(xiàn)少量致密濃染，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整；高濃度九香蟲(chóng)水煎液(圖4-d、e)作用下細(xì)胞出現(xiàn)明顯裂解，可見(jiàn)濃染致密的塊狀熒光。較對(duì)照組，試驗(yàn)組細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核染色增強(qiáng)，且隨著濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)破碎。綜上所述，九香蟲(chóng)水煎液能顯著促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。s

圖4 Hoechst 33258染色法檢測(cè)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響(100x)Fig.4 Effect of A.chinensis decoction on the apoptosis of HepG2 cells for 24 h detected by Hoechst 33258 staining method (100x)

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在腫瘤的研究與運(yùn)用逐漸受到重視。藥用昆蟲(chóng)是指其蟲(chóng)體或產(chǎn)物具有治療疾病的昆蟲(chóng)，是癌癥治療藥物重要的組成部分。研究表明，斑蝥素、蜣螂毒素、蟑螂油等具有良好的抗癌活性；此外，蜜蜂、螞蟻、胡蜂等膜翅目及部分蝶類(lèi)昆蟲(chóng)體內(nèi)也具有一定的抗癌活性物質(zhì)。

九香蟲(chóng)作為一種傳統(tǒng)藥食兩用昆蟲(chóng)，其傳統(tǒng)中藥復(fù)方多有用于抗癌，如九香巖痛寧(九香蟲(chóng)、鼠婦、元胡等)、癌痛克(金蝎、九香蟲(chóng)、土元等)、復(fù)方香龍散(九香蟲(chóng)、半夏、天龍等)，等。隨著研究的不斷深入，針對(duì)其單獨(dú)抗癌作用也開(kāi)展了諸多研究：如九香蟲(chóng)含藥血清可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)因子的表達(dá)；九香蟲(chóng)血淋巴可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞體外增殖；九香蟲(chóng)三氯甲烷浸出物、水提液、乙醇粗提物等可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期達(dá)到抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細(xì)胞的增殖作用；并進(jìn)一步從其體內(nèi)純化獲得可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的CHP蛋白。本研究則進(jìn)一步明確了其對(duì)肝癌的抑制作用，也是九香蟲(chóng)單藥水煎液模式對(duì)肝癌抑制作用的首次探索。本研究可為九香蟲(chóng)這一優(yōu)良中藥的深入系統(tǒng)應(yīng)用提供參考。

其次，在已獲得的九香蟲(chóng)多種組分中，水煎液的制作方式更加簡(jiǎn)單、快速。因而本文探討了九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)九香蟲(chóng)水煎液對(duì)肝癌細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力以及對(duì)細(xì)胞凋亡與自噬作用的影響與藥物濃度呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明九香蟲(chóng)水煎液具有顯著抑制肝癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的作用，且其肝癌HepG2細(xì)胞的IC為26.23 mg/mL。而田瑩等發(fā)現(xiàn)，九香蟲(chóng)單藥水煎液對(duì)乳腺癌MDA-MB-453、4T1細(xì)胞的IC分別為34 mg/mL、101 mg/mL，初步表明九香蟲(chóng)水煎液相較于乳腺癌MDA-MB-453、4T1細(xì)胞更有效果。另外，侯曉暉等利用九香蟲(chóng)乙醇粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞的IC為582 μg/mL，相較于水煎液，其抗癌功效似乎更高，這可能與昆蟲(chóng)體內(nèi)物質(zhì)更多是醇溶性有關(guān)，乙醇可以更有效地萃取出九香蟲(chóng)體內(nèi)的抗癌活性物質(zhì)，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

此外，作為一種湯劑，水煎液具有易吸收、見(jiàn)效快以及隨癥加減的特點(diǎn)，在臨床上具有良好的應(yīng)用潛能，但水煎液中可溶解的藥物成分多種多樣，確切的藥用成分及其對(duì)肝癌細(xì)胞抑制的具體分子機(jī)制仍不明確，也有待進(jìn)一步研究。