孫宇燕，李樹生，郝文勝，梁東超，劉 羽，昊 翔，徐 暢，張龍梅，侯佳秀，馬麗榮

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)原產(chǎn)于南美洲，因高產(chǎn)、適應(yīng)性廣、營養(yǎng)成分全和產(chǎn)業(yè)鏈長而受到全世界的高度重視[1-2]。中國是世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國,總栽培面積約600 萬hm2, 年產(chǎn)量在9000 萬t,在我國是僅次于水稻、玉米、小麥的重要糧食作物[3]。目前，我國主栽馬鈴薯品種為四倍體植株，在馬鈴薯育種上,大多數(shù)采用大田雜交的方法,選育出了一批優(yōu)良性狀的品種[4-5]。但由于馬鈴薯的材料比較單一, 性狀優(yōu)良的親本匱乏，以及雜交技術(shù)的影響，長久以來大大降低了育種工作效率[6-7]。

隨著我國生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種逐步成為了我國農(nóng)作物育種的一個(gè)重要方向[8-9]。

簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat,SSR)是近年來廣受學(xué)者歡迎的新型分子標(biāo)記技術(shù)[10]。 相比其他常用的標(biāo)記技術(shù),SSR 標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、 準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn), 被廣泛運(yùn)用于農(nóng)作物品種鑒定及指紋圖譜構(gòu)建中[11]。 其余是以目的基因片段為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 這種方法已在玉米、小麥、甘薯等多種農(nóng)作物體內(nèi)研究應(yīng)用[12-14]。

陳其福等[15]以14 個(gè)菜豆品種為材料,采用SSR分子標(biāo)記技術(shù),對其進(jìn)行遺傳多樣性研究,并建立了特異性指紋圖譜。 溫賀等[16]采用已報(bào)道的66 對SSR 引物對不同來源的42 份紫蘇材料進(jìn)行擴(kuò)增，對紫蘇遺傳多樣性及種群劃分進(jìn)行研究,充分證明了SSR 分子標(biāo)記在作物輔助育種，以及親緣關(guān)系鑒定等方面的重要作用。

本文利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對內(nèi)蒙古常見的36個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行基因組掃描,對遺傳差異性進(jìn)行分析，旨在為馬鈴薯分子輔助育種、圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以布爾班克等共計(jì)36 份品種為試驗(yàn)材料（見表1）。

表1 36 份試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯基因組DNA 提取及檢測。選取馬鈴薯新鮮嫩葉，采用TIANGEN 新型植物基因組DNA 提取試劑盒提取材料的基因組DNA 并用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測，挑選條帶清晰完整、亮度好的DNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR 反應(yīng)。STM1053、STM0030、STM1049、STM1104、STM1106、STM2022、STM2013、STM0037、STM0019、STM3012、STM3023、STM1053、STM1053 共13 對SSR 引物序列來自Ghislain M （Chislain M et al,2014）等，由華大基因公司合成。

PCR 反應(yīng)體系采用于卓等[17]的體系略有改動(dòng)，具體為2×Taq PCR Master Mix 5 μL，50 ng/μL 上、下游 引 物 各1 μL，100 ng/μL 模 板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL，共計(jì)20 μL。

PCR 運(yùn)行程序設(shè)置為：

1.2.3 電泳檢測。（1）電泳過程：將凝固好的變性膠固定到電泳儀上，上下兩極倒入1.0×TBE 緩沖液（沒過膠面），利用洗耳球吹除拔梳子所留殘膠，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入PAGE 變性劑5 μL, 在PCR 儀中95 ℃變性5 min 后，向點(diǎn)樣孔中點(diǎn)入6 μL，70 W 恒功率電泳1～1.5 h。 （2）顯影步驟：

1.2.4 SSR 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)電泳結(jié)果中條帶的有無，采用“0/1”系統(tǒng)對擴(kuò)增后清晰易讀的條帶進(jìn)行記錄，在相同的遷移位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”，按基因片段由大到小的順序記錄，構(gòu)建“0，1”矩陣。利用qtree 1.6.1 分析軟件。利用MEGA X 軟件，按照距離法對36 個(gè)品種建立進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 檢測結(jié)果

對提取的群體DNA 進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測（圖1），由圖可見，提取的DNA 樣品條帶清晰完整，無降解拖尾現(xiàn)象，未見RNA 和蛋白質(zhì)污染，DNA 純度高，符合后續(xù)試驗(yàn)要求，將DNA 稀釋到100 ng/μL，于-20 ℃保存。

2.2 SSR 多態(tài)性引物篩選結(jié)果

經(jīng)篩選得到可用于下一步分析的引物11 對，具體見表2。

2.3 SSR 擴(kuò)增結(jié)果分析

試驗(yàn)采用11 對SSR 標(biāo)記引物（表2）對36 份馬鈴薯材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如表3 所示。

表2 SSR 引物序列

由表3 可知，11 對引物組合共檢測到70 個(gè)等位位點(diǎn)，其中66 個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性百分率94.2%；DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小多在300～500 bp之間，表明供試材料的SSR 多態(tài)性豐富。 每對引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為4～9 個(gè)，平均每對引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為6.4 個(gè)。 其中（圖2），引物STM2013 和STM3023 多態(tài)性條帶最多，為9 條；引物STM1053 多態(tài)性條帶最少，僅有2 條。

表3 36 份材料部分SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

表4 構(gòu)建的馬鈴薯基因指紋圖譜

2．4 聚類分析結(jié)果

2.4.1 聚類分析。根據(jù)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫，利用qtree 1.6.1 分析軟件，按照最大似然法進(jìn)行聚類分析，計(jì)算不同馬鈴薯品種（系）間的遺傳距離。

聚類分析結(jié)果(圖3)表明，在相似系數(shù)18 附近，36 份馬鈴薯品種可分為4 類。

Ⅰ：1（布爾班克）；

Ⅱ：27（V7）；

Ⅲ：14、9、23、34、26、22、21、17、10、11；

Ⅳ：20、35、15、8、19、16、13、24、25、3、4、6、28、18、29、12、2、33、31、30、36、7、32、5。

在以上的分類中，5 號（希森3 號）和32 號（X）聚為一類，4 號（E44 夏坡地）和6 號（夏坡地456）聚為一類，證明用SSR 分子標(biāo)記能夠正確地按照相似性將馬鈴薯進(jìn)行分類，為馬鈴薯雜交育種中親本的選擇和雜種優(yōu)勢的利用提供理論依據(jù)。

2.4.2 NJ 進(jìn)化樹。根據(jù)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1 統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫，利用MEGA－X 軟件，按照距離法對36 個(gè)品種建立NJ 進(jìn)化樹。

由NJ 進(jìn)化樹（圖4）可以看出，8、35 的親緣性較近，9、23 的親本親緣性較近，同時(shí)與20、14、9、23 的親緣相近，36 份馬鈴薯按照親本的遠(yuǎn)緣性分為4 類。

Ⅰ：23、9、14、20、35、8；

Ⅱ：17、10、11、15、22、34；

Ⅲ：21、1、27、30、36、32、5、7；

Ⅳ：26、28、29、18、19、16、13、24、12、2、31、33、25、3、4、6。

3 討論

中國不是馬鈴薯原產(chǎn)地，馬鈴薯資源從世界不同地區(qū)引進(jìn)，經(jīng)過人工選育后形成現(xiàn)有的品種及品系，因此，在國內(nèi)不同地方收集的資源不能按地域性聚集在一起。

由于遺傳資源狹窄，供試36 份材料聚類分析結(jié)果相似性較高，然而11 對SSR 引物的擴(kuò)增產(chǎn)物所展示出的多態(tài)性與決定某個(gè)表型的基因是否有關(guān)聯(lián)還有待研究，通過ML 分析聚成一類的品種，其表型關(guān)聯(lián)還需深入研究，NL 分析所產(chǎn)生的進(jìn)化樹，其進(jìn)化機(jī)制也需完善。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過11 對引物，擴(kuò)增內(nèi)蒙古自治區(qū)36 個(gè)品種，結(jié)果表明，內(nèi)蒙古主栽品種間存在遺傳差異性，但是通過遺傳距離進(jìn)行聚類分析，36 個(gè)品種聚合成4類，品種間遺傳距離較近；NJ 進(jìn)化樹分析也表明，品種的同源性較大，品種分離進(jìn)化較小。

本試驗(yàn)僅選取內(nèi)蒙古部分主栽品種，有局限性，后續(xù)會(huì)選取其他地域馬鈴薯資源進(jìn)行驗(yàn)證，以期為選擇遺傳差異大的材料，拓寬馬鈴薯后代遺傳背景，提高后代雜種優(yōu)勢，培育優(yōu)良的新品種發(fā)揮重要作用，為馬鈴薯的育種親本和雜種優(yōu)勢提供理論依據(jù)。