陳桃香，吳海燕，李春寧，胡成剛

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

鳳仙花來源于鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花ImpatiensbalsaminaL.全株，又稱指甲花，其種子稱急性子，被收載于2020版中國藥典。鳳仙花是苗族常用的一味藥材，在苗醫(yī)理論中，其味麻辣，性熱，入冷經(jīng)，快經(jīng)，半邊經(jīng)，有小毒。它具有活血化瘀、止痛解毒、祛風(fēng)除濕接骨等功效。用于治療喉蛾，痞塊不消，骨鯁，噎食不下。莖常用于治療骨折，骨質(zhì)增生；花常用于治療甲癬[1]。鳳仙花資源豐富，全國有270余種，主要分布在我國西南地區(qū)[2～4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鳳仙花提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化并建立了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期開發(fā)和利用鳳仙花植物資源，為臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-2030C液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、在線排氣、紫外檢測(cè)器)；MODEL BX43F 光學(xué)顯微鏡(配成像系統(tǒng))；電子天平(型號(hào)：FA1004N，廠家：上海菁海儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：GZX-9070MBE，廠家：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；恒溫水浴鍋(型號(hào)：HWS-24型，廠家：上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；人工智能氣候箱(型號(hào)：RQX-400B，廠家：常山市華普達(dá)教學(xué)儀器公司)；硅膠G薄層板。

1.2 材料

鳳仙花藥材均采自貴州省，共10個(gè)批次(詳細(xì)信息見表1)，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館胡成剛教授鑒定為鳳仙花科鳳仙花屬植物鳳仙花ImpatiensbalsaminaL.全株。2-甲氧基-1，4-萘醌對(duì)照品(批號(hào)：S20F719925，廠家：上海源葉生物科技有限公司，含量≧98%)，正己烷、乙酸乙酯、甲酸、苯、甲醇、庚烷、三氯甲烷、磷鉬酸均為分析醇。

表1 藥材樣品信息表Tab.1 Information of the medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

鳳仙花的全株分根、莖、葉子、花、果實(shí)和種子六個(gè)部分。葉互生，最下部葉有時(shí)對(duì)生；葉片披針形、狹橢圓形或倒披針形。花單生或2～3朵簇生于葉腋，無總花梗，白色、粉紅色或紫色，單瓣或重瓣。蒴果寬紡錘形，長(zhǎng)10～20 mm，兩端尖，密被柔毛；種子多數(shù)，圓球形，直徑1.5～3 mm，黑褐色。

2.2 顯微鑒別

粉末呈黃綠色，可見少量單細(xì)胞和多細(xì)胞的非腺毛，有較多的草酸鈣針晶及晶鞘纖維，多見草酸鈣方晶及簇晶，各種導(dǎo)管及纖維束多見，有少量橢圓形花粉粒，表面可見網(wǎng)狀雕紋，葉碎片少許，表面可見平軸式氣孔。結(jié)果見圖1。

圖1 鳳仙花藥材粉末顯微鑒定圖Fig.1 Microscopic identification of Impatiens balsamina powder

2.3 薄層鑒別

2.3.1 供試品、對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鳳仙花藥材粉末5 g，加入95%的乙醇50 mL回流提取兩次，每次1 h，過濾，合并兩次濾液，即得供試樣品提取液[5]。精密稱取2-甲氧基-1，4-萘醌對(duì)照品5 mg，加入甲醇制成10 mL，使其充分溶解，即得0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 方法

按照2015版中國藥典四部通則薄層色譜法(通則0502)[6]，分別吸取2-甲氧基-1，4-萘醌對(duì)照品溶液和鳳仙花的供試品溶液適量，點(diǎn)于已經(jīng)活化及飽和后的硅膠G薄層板上，以苯-甲醇(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干后，以磷鉬酸為顯色劑進(jìn)行檢視，結(jié)果見圖2。在硅膠板上，槲皮素對(duì)照品溶液與不同產(chǎn)地的馬桑樣品在相應(yīng)位置顯示清晰顏色相同的熒光斑點(diǎn)，分離效果及重復(fù)性良好，具體見圖2。

圖2 鳳仙花薄層鑒別圖Fig.2 Thin-layer identification of Impatiens balsamina

2.4 檢查與浸出物的測(cè)定

按照2015版中國藥典中各通則項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)要求，通則0832水分測(cè)定法(烘干法)、2302灰分測(cè)定法(總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定法以稀鹽酸測(cè)定酸不溶性灰分)、2201浸出物測(cè)定法(熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物，以40%乙醇為溶劑)測(cè)定[6]，結(jié)果見表2。

表2 樣品水分、總灰分酸不溶性灰分和浸出物含量測(cè)定結(jié)果(%，n=3)Tab.2 Determination results of contents of water，total ash，acid-insoluble ash and extract(%，n=3)

2.5 提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溶劑的濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)作為考察因素，以提取出的鳳仙花2-甲氧基-1，4-萘醌含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選最佳工藝。正交試驗(yàn)與水平因素見表3，正交試驗(yàn)見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 因素水平表Tab.3 Factor-level table

表4 正交試驗(yàn)表Tab.4 Orthogonal testresults

表5 方差分析表Tab.5 Analysis of Variance

試驗(yàn)結(jié)果表明，影響鳳仙花提取工藝的因素大小順序?yàn)樘崛∪軇舛?A)>料液比(B)>提取時(shí)間(C)。得到鳳仙花最佳提取工藝為A3B3C2，具體操作為：精密稱取鳳仙花藥材粉末1 g，用純甲醇100 mL，每次提取時(shí)間為1 h。

2.6 2-甲氧基-1，4-萘醌的含量測(cè)定研究

2.6.1 色譜條件

COSMOSIL Cholester C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：A相為純水，B相為乙腈；梯度洗脫：0～5 min，10%～35%(B)，5～15 min，35%～35%(B)，15～20 min，35%～65%(B)，20～21 min，65%～10%(B)，21～30 min，10%～10%(A)檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖3。

圖3 2-甲氧基-1，4-萘醌色譜圖Fig.3 Chromatogram of 2-methoxy-1，4-naphthoquinone

2.6.2 供試品溶液的制備

精密稱取鳳仙花藥材粉末1 g，加入100 mL的甲醇溶液，稱定重量，在90 ℃下回流提取1 h，放冷至室溫，稱定重量[7]，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥的濾紙過濾后，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后即得供試品溶液[8]。

2.6.3 線性關(guān)系考察[9]

精密稱取2-甲氧基-1，4-萘醌對(duì)照品適量，加甲醇配成0.06 mg/mL溶液，稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度(0.003 mg/mL、0.018 mg/mL、0.03 mg/mL、0.042 mg/mL、0.054 mg/mL)，各吸取10 μL，平行3份，按“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，2-甲氧基-1，4-萘醌質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=6×107X-16256(r=0.9997)，在3.4～54.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到2-甲氧基-1，4-萘醌峰面積RSD為0.22%，儀器精密度良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下的色譜條件，根據(jù)0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)得2-甲氧基-1，4-萘醌峰面積RSD為1.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)藥材粉末6份，按“2.6.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，根據(jù)“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件，注入色譜儀中測(cè)定，得到2-甲氧基-1，4-萘醌含量的RSD為0.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.7 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定同一批次鳳仙花藥材粉末0.5 g，共6份，每份精密加入對(duì)照品0.3 mg，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.6 Spiked recovery rate(n=6)

2.6.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取各產(chǎn)地鳳仙花粉末1 g，平行3份，按“2.6.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 鳳仙花的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.7 Determination results of Impatiens balsamina(n=3)

3 結(jié)論與討論

本次研究分別從定性鑒別、定量測(cè)定兩部分對(duì)鳳仙花進(jìn)行了研究，鳳仙花藥材粉末中特征明顯，可作為鑒定鳳仙花藥材真?zhèn)蔚蔫b定依據(jù)。結(jié)合參考文獻(xiàn)及藥典其他藥材檢查，暫定鳳仙花各檢查指標(biāo)含有量為水分不超過17.0%，總灰分不超過22.0%，酸不溶性灰分不超過0.33%，醇溶性浸出物不低于17.0%。

鳳仙花主要含黃酮醇類及萘醌類衍生物，其中2-甲氧基-1，4-萘醌為鳳仙花所含成分中最主要的抗真菌化學(xué)成分[10]，而且鳳仙花的根中還含有指甲醌、東莨菪素等，具有抗真菌、抗過敏、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[10-12]。鳳仙花是苗族民間用于治療爛癬、頑癬、手足氣等疾病的常用藥，基于開發(fā)治療皮膚癬類疾病苗藥新制劑，故選用2-甲氧基-1，4-萘醌作為質(zhì)量控制的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)，考察了提取溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比等3個(gè)單因素，在單因素考察的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)選出鳳仙花2-甲氧基-1，4-萘醌成分提取的最佳提取方法為甲醇、料液比為1∶100，提取時(shí)間為1 h?？疾炝瞬煌牧鲃?dòng)相(甲醇-水、乙腈-水)，發(fā)現(xiàn)后者分離效果優(yōu)于前者，故采用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫。紫外掃描顯示，最大吸收波長(zhǎng)位于280 nm，故將其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。