譚正瑩，龔會琴，尹君靜，廖朝選，包 娜

(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014)

螨類害蟲是果園中主要的害蟲，其繁殖力強(qiáng)，隱蔽性高，危害性大，人們?yōu)榱吮Ｕ瞎麍@的生產(chǎn)，使用了大量的殺螨農(nóng)藥，但同時(shí)也產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境問題[1]。環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估是指導(dǎo)農(nóng)藥科學(xué)使用的重要利器，對保障生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展意義重大。殺螨農(nóng)藥在果園中施用后，漂移至地面或在葉片上殘留的農(nóng)藥可能隨雨水沖刷、土壤淋溶等進(jìn)入水體，可能造成水生態(tài)系統(tǒng)的破壞。魚類作為水生態(tài)系統(tǒng)中處于食物鏈上層的主要生物，研究其急性毒性和生物富集效應(yīng)可為風(fēng)險(xiǎn)評估提供重要的數(shù)據(jù)。

乙螨唑(Etoxazole)是2，4-二苯基噁唑衍生物類化合物，可抑制螨卵的胚胎形成以及從幼螨到成螨的蛻皮過程，對螨類害蟲從卵、幼蟲到蛹都具有優(yōu)異的觸殺作用[2]。當(dāng)前有效登記的乙螨唑產(chǎn)品有141個，主要用于柑橘、蘋果等果樹上紅蜘蛛(Tetranychuscinnbarinus)等螨類的防治[3]，其大量的登記使用，對環(huán)境可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。研究表明，乙螨唑可引起斑馬魚的卵黃囊和心臟水腫，活力喪失、心率異常和發(fā)育不全，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及體內(nèi)富集[4-5]。也有研究表明，在推薦田間用藥量下，乙螨唑會嚴(yán)重影響加州新小綏螨的卵孵化率[6]。本研究通過乙螨唑原藥對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)，可為全面評價(jià)乙螨唑在環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)數(shù)據(jù)，指導(dǎo)農(nóng)藥安全使用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物

斑馬魚(Daniorerio)：幼魚購自上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場，置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)持續(xù)飼喂直至試驗(yàn)前1 d。試驗(yàn)魚健康無病，試驗(yàn)前7 d死亡率低于5%，體重0.25～0.30 g。

1.2 試劑與溶液

乙螨唑標(biāo)樣(99.0%，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心)；乙螨唑樣品(96%，來自貴州省分析測試研究院)；乙腈(色譜純，Merck KGaA)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；碳酸鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；曝氣生態(tài)水：經(jīng)活性炭與曝氣脫氯48 h的自來水，溶解氧約101%ASV，硬度190 mg/L(以CaCO3計(jì))，pH值約8.0。

1.3 儀器

Agilent 1290/6470A液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；ZD-85A氣浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司)；HQ30D溶解氧測定儀(美國哈希公司)，LD5-10離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)，F(xiàn)E20K酸度計(jì)(梅特勒-托利多(中國)有限公司)，YD300硬度計(jì)(上海三信儀表廠)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，0.0001 g)，DT500A電子天平(常熟意歐儀表有限公司，0.01 g)，移液器(Eppendorf，100～1000 μL)；SK250H超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)參考GB/T31270.12—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)，采用靜態(tài)試驗(yàn)法測定了96%乙螨唑原藥對斑馬魚的急性毒性。以丙酮作為助溶劑(最高濃度為0.1 mL/L)，用曝氣生態(tài)水設(shè)置了0.903 mg/L、1.10 mg/L、1.34 mg/L、1.64 mg/L、2.00 mg/L濃度組，并設(shè)空白對照組和助溶劑對照組進(jìn)行試驗(yàn)暴露。為減少生物使用，試驗(yàn)不設(shè)平行，每組制備5 L藥液，加入10尾魚進(jìn)行試驗(yàn)暴露。整個試驗(yàn)在23 ℃±2 ℃、16 h光照/8 h條件下進(jìn)行，試驗(yàn)開始后每日觀察并記錄斑馬魚的中毒與死亡情況。為確保試驗(yàn)的有效性，每日測定試驗(yàn)溶液的溫度、pH值和溶解氧，并在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)分別測定試驗(yàn)溶液濃度。

1.4.2 生物富集試驗(yàn)

生物富集試驗(yàn)是通過魚類暴露于一定濃度的農(nóng)藥中，在8 d的時(shí)間內(nèi)持續(xù)采樣分析，通過魚體內(nèi)農(nóng)藥含量與水中濃度對比確定富集系數(shù)，評估其富集程度。主要的研究方法有靜態(tài)試驗(yàn)法、半靜態(tài)試驗(yàn)法和流水式試驗(yàn)法，主要通過農(nóng)藥在水中的穩(wěn)定性(≥80%初始濃度)確定，試驗(yàn)的濃度常結(jié)合農(nóng)藥對魚類的急性毒性，取96 h-LC50的1/10和1/100兩個質(zhì)量濃度用于暴露。設(shè)定了0.0155 mg/L和0.155 mg/L兩個濃度組，以及空白對照組和助溶劑對照組，采用半靜態(tài)試驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)暴露，換液周期為48 h。

準(zhǔn)確稱取0.0105 g 96%乙螨唑原藥于稱量瓶中，用丙酮溶解并完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容至刻度，得到1.0 mg/mL的母液。分別取465 μL、4.65 mL加入30 L暴露試驗(yàn)用水中，以2500 r/min攪拌20 min后制備得0.0155 mg/L和0.155 mg/L的暴露試驗(yàn)藥液，然后加入50尾魚用于試驗(yàn)。試驗(yàn)各組均設(shè)2個重復(fù)，于23 ℃±2 ℃、16h光照/8 h條件下進(jìn)行。試驗(yàn)開始后每日喂食0.14 g，喂食完畢后采用50 mL移液管將容器底部的糞便、食物殘?jiān)惹謇砀蓛?，并在試?yàn)開始后0 h、12 h、24 h、48 h、96 h、144 h、196 h定期采集魚樣和水樣，測定乙螨唑濃度。

1.4.3 分析方法

結(jié)合王蒙岑[7]、何智宇[8]建立的乙螨唑分析方法，優(yōu)化流動相及色譜條件，確定儀器分析方法。液相色譜分析條件：色譜柱為Agilent Extend-C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)、柱溫為30 ℃、流動相采用0.1%甲酸水/乙腈(V/V=40∶60)、進(jìn)樣體積5 μL、流速0.3 mL/min、運(yùn)行時(shí)間：6 min。質(zhì)譜條件為ESI+模式，MRM掃描，溫度(300 ℃)，F(xiàn)ragment(118 V)，定性/定量離子對(304.1/117，304.1/140.9)。

1.4.4 樣品前處理

水樣：使用移液管從試驗(yàn)缸的中部取試驗(yàn)液5 mL，高濃度組藥液用曝氣生態(tài)水進(jìn)行10倍稀釋，然后經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后待測。

魚樣：取7尾試驗(yàn)魚于燒杯中，用去離子水清洗表面，然后用濾紙吸干水分，再使用剪刀割剪斷脊柱使其死亡，稱重后置于研缽中。加入2 g NaCO3進(jìn)行研磨，研細(xì)后使用25 mL乙腈轉(zhuǎn)移至250 mL具塞三角瓶中超聲20 min，恒溫(20 ℃±2 ℃)振蕩提取1 h，離心5 min(4000 r/min)，稀釋一定倍數(shù)后取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后待測。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

魚類急性毒性試驗(yàn)的96 h的LC50值與95%置信限采用SPSS19.0進(jìn)行Probit回歸分析。斑馬魚對乙螨唑的富集系數(shù)(BCF)，通過公式BCF=Cfs/Cws計(jì)算，式中：BCF為生物富集系數(shù)；Cfs為平衡時(shí)魚體內(nèi)的農(nóng)藥含量(mg/kg)，Cws為平衡時(shí)水體中的農(nóng)藥含量(mg/L)。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中的分級標(biāo)準(zhǔn)，對乙螨唑?qū)Π唏R魚的急性毒性和生物富集性進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用乙腈配制1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L和100.0 μg/L的乙螨唑系列工作溶液，在上述液相色譜和質(zhì)譜條件下分析，將濃度(X)與峰面積(Y)進(jìn)行線性擬合，其回歸方程為：

y=25757.20x+2399.465

相關(guān)系數(shù)R2=0.99998。結(jié)果表明，乙螨唑在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.1.2 添加回收率試驗(yàn)

水樣添加回收率測定： 分別取100.0 μg/L的工作溶液0.10 mL、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用曝氣生態(tài)水制備為1.0 μg/L和 10.0 μg/L的加標(biāo)水樣，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，然后按上述前處理與分析方法測定含量。該方法下，水中乙螨唑的回收率為 98.5% ～103.1%，最低檢測濃度為1.0 μg/L。

魚樣添加回收率測定： 取2.00 g魚漿，向其中添加0.025 μg、0.25 μg乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)品，制備為0.0125 mg/kg、0.125 mg/kg的加標(biāo)魚樣，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，然后按上述前處理與分析方法測定含量。該方法下，魚樣中乙螨唑的回收率為 92.0%～105.6%，最低檢測濃度為0.0125 mg/kg。

2.2 乙螨唑?qū)Π唏R魚的急性毒性

試驗(yàn)期間溶液的溫度為22.1～24.4 ℃，溶解氧為75.5%～102.7%ASV，pH值為7.72～8.22，滿足環(huán)境條件要求?？瞻讓φ蘸椭軇φ战M中供試魚均未發(fā)生死亡，死亡率低于10%，試驗(yàn)期間各組濃度保持在初始濃度的87.3%～101.2%范圍，符合試驗(yàn)有效性規(guī)定。設(shè)定的濃度0.903 mg/L、1.10 mg/L、1.34 mg/L、1.64 mg/L、2.00 mg/L各組中，供試魚在8 h后即發(fā)生快速游動、側(cè)翻的中毒癥狀，24 h后出現(xiàn)平躺現(xiàn)象，伴隨死亡發(fā)生，96 h后存活魚出現(xiàn)游動遲緩、體色變深。

將試驗(yàn)濃度與斑馬魚死亡率經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析，乙螨唑?qū)Π唏R魚的96 h-LC50=1.55 mg/L，95%置信限為1.39～1.75 mg/L。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中對魚類急性毒性的等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，乙螨唑?qū)Π唏R魚急性毒性的96 h-LC50介于1.0～10.0 mg/L之間，為“中毒”類農(nóng)藥。

2.3 乙螨唑在斑馬魚體內(nèi)的生物富集性

半靜態(tài)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，隨暴露時(shí)間的增加，斑馬魚對乙螨唑的富集系數(shù)BCF逐漸增大，變化情況見圖1。在0.0155 mg/L濃度中，BCF8d=4425 L/kg，在0.155 mg/L濃度下，BCF8d=3305 L/kg，詳細(xì)結(jié)果見表1。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中“農(nóng)藥生物富集等級劃分”，乙螨唑的生物富集系數(shù)BCF8d>1000，為高富集性農(nóng)藥。

圖1 生物富集系數(shù)隨時(shí)間變化圖Fig.1 Changes of bioconcentration factor with time

表1 乙螨唑的魚類生物富集系數(shù)(BCF)Tab.1 The bioconcentration factor of etoxazole in fish

3 結(jié)論

對于微溶于水的農(nóng)藥，開展水生生物試驗(yàn)時(shí)常使用有機(jī)溶劑助溶，但使用助溶劑需確保不對試驗(yàn)產(chǎn)生影響。乙螨唑微溶于水，使用丙酮助溶后在水中分散更加快速、均勻，在急性毒性和生物富集試驗(yàn)的助溶劑對照組中斑馬魚均未發(fā)生死亡，表明其助溶效果好且對試驗(yàn)的影響較小。

農(nóng)藥對靶標(biāo)生物具有良好活性，但同時(shí)對非靶標(biāo)生物也有一定的藥害，其環(huán)境安全問題一直受到廣泛關(guān)注。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙螨唑?qū)Π唏R魚的急性毒性為“中等毒性”，是當(dāng)前替代高毒、劇毒農(nóng)藥的主要類型。但乙螨唑容易在斑馬魚體內(nèi)蓄積，具有“高富集性”，其對魚類的長期危害需要特別注意。在田間應(yīng)用時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格控制其使用量與范圍，以避免進(jìn)入水體造成生態(tài)系統(tǒng)破壞。同時(shí)乙螨唑具有一個手性中心，存在兩個降解、毒性均有一定差異的對映異構(gòu)體，而且在土壤和蚯蚓體內(nèi)均能產(chǎn)生具有一定持久性的代謝物M1(C21H21F2NO2)和M3(C21H21F2NO4)[9]。為了更加全面、準(zhǔn)確地評價(jià)乙螨唑的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，不同對映體以及代謝產(chǎn)物對非靶標(biāo)生物的毒性影響以及環(huán)境歸趨特征還需進(jìn)一步研究。