覃春葉，何佳佳，陳子愉，陳志琳，李 瑋，杜洪志

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.是小檗科淫羊藿屬植物，藥用部位為葉，其味辛甘，性溫，具有補肝腎，強筋骨，祛風濕的作用[1]。主要含有黃酮及其苷類、生物堿、多糖、木脂素等成分，具有抗骨質(zhì)疏松、延緩衰老、抗腫瘤[2-8]等藥理作用，臨床上多用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征等疾病[9-10]。市場上，箭葉淫羊藿藥材使用廣，是很多中成藥的主要原料之一，如仙靈骨葆膠囊、益腎靈顆粒、抗骨增生片等。中藥材質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到中成藥的質(zhì)量，藥材不同采收期、不同部位、不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格等級都與中藥材的質(zhì)量息息相關[11-12]。目前，《中藥材商品規(guī)格等級(226)種》中按照傳統(tǒng)分級方法，即葉片占比和碎葉占比和色澤將箭葉淫羊藿分為一等、二等和統(tǒng)貨，沒有結合現(xiàn)代質(zhì)量控制指標綜合評價該藥材商品規(guī)格等級質(zhì)量，已不符合當前中藥材的生產(chǎn)、流通、使用，制約了箭葉淫羊藿藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，制定科學、全面的箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級質(zhì)量評價方法，對于保證臨床療效、合理利用藥材、優(yōu)質(zhì)優(yōu)價都具有重要意義。

研究表明，淫羊藿的不同藥用部位中，淫羊藿苷以及總黃酮類成分的含量有所差異，含量最高的部位在葉片，葉柄和莖含量較低[13]；同時，葉類藥材的等級劃分較為簡單，主要按照藥材的外觀性狀、顏色、含雜質(zhì)率等劃分[14]?；诖?，筆者將箭葉淫羊藿藥材外觀性狀與內(nèi)在品質(zhì)相結合，建立該藥材等級質(zhì)量評價方法，以期為箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級質(zhì)量標準的修訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1810型紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)、ME204E型萬分之一電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海況勝實業(yè)發(fā)展公司)、HS10260D型超聲波清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品(批號：110737-200414，購于中國藥品生物制品檢定所，純度≥99%)、甲醇和乙醇均為分析純、實驗用水為蒸餾水。

16批箭葉淫羊藿藥材均由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司提供。由貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定，為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.的全草。具體信息見表1。

表1 箭葉淫羊藿藥材產(chǎn)地及批號Tab.1 Origins and batch numbers of Epimedium sagittatum medicinal materials

2 方法與結果

2.1 分級要點

根據(jù)2020版《中國藥典》對箭葉淫羊藿的質(zhì)量要求，結合葉片顏色、葉片所占比例(重量比)、其他非藥用雜質(zhì)、含量測定指標總黃酮進行等級劃分。

一等：全部為三出復葉(小葉)，葉片綠色，完整，無蟲蛀，不含葉柄(葉枝)，葉片所占比例為100%，無雜質(zhì)。

二等：有一部分為三出復葉(小葉)，葉片綠色，完整，無蟲蛀，含葉柄(葉枝)，含較短的葉枝，無雜質(zhì)。

三等：有一部分為三出復葉(小葉)，葉片綠色，完整，無蟲蛀，含葉柄(葉枝)比例較二等品多，含較長葉枝和較短葉枝，無雜質(zhì)。

統(tǒng)貨：原藥材。

2.2 分級方法

每一個批次根據(jù)葉片顏色，有無雜質(zhì)，蟲蛀，是否完整，劃分為3個等級和統(tǒng)貨，并計算各批次各等級葉片占比和葉柄占比。

2.3 藥材顏色測定

采用主觀結合客觀方法綜合評價藥材顏色。主觀方法即感官觀察藥材未打粉之前葉片的顏色；客觀方法即是用色度測量儀測定箭葉淫羊藿藥材打粉之后樣品粉末的顏色，以L、a、b表示色度值，其中L為亮度值，值越大表示亮度越高；a為色度值，“+”表示紅色，值越大顏色越紅，“-”表示綠色，值越小顏色越綠；“b”為彩度值，“+”表示黃色，值越大顏色越黃，“-”表示藍色，值越小顏色越藍。

2.4 水分測定

照2020版《中國藥典》第四部通則0832項下“水分測定法”烘干法測定藥材水分含量。

2.5 浸出物測定

照2020版《中國藥典》第四部通則2201項下“浸出物測定法”，分別以水和50%乙醇為溶劑，按熱浸法測定藥材水溶性和醇溶性浸出物含量。

2.6 總黃酮測定

2.6.1 對照品溶液的制備

精密稱取2.5 mg的淫羊藿苷對照品置于25 mL的容量瓶中，加甲醇定容，搖勻。取1 mL該溶液置于10 mL容量量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL含0.01 mg的溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 供試品溶液的制備

取供試品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理1 h，取出，補重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液0.35 mL加甲醇定容到25 mL即得供試品溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.3 標準曲線制備

精密量取不同體積的淫羊藿苷對照品溶液，配置成濃度分別為0.006 mg/mL、0.01 mg/mL、0.014 mg/mL、0.016 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL一系列對照品溶液。在270 nm處測定其吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，求得回歸方程Y=31.801X+0.0118(r=0.9998)，淫羊藿苷濃度在0.006～0.03 mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6.4 精密度試驗

取濃度為0.01 mg/mL淫羊藿苷對照品溶液，在270 nm處下連續(xù)測定6次，分別測定吸光度，計算其RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.5 重復性試驗

取箭葉淫羊藿藥材樣品6份，每份約0.2 g，精密稱定，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，在270 nm波長下測定其吸光度，計算總黃酮含量的RSD為2.1%，表明方法重復性良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份箭葉淫羊藿藥材樣品，約0.2 g，精密稱定，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，在270 nm波長下測定其吸光度，每隔1 h測定吸光度，連測6次，吸光度RSD為0.60%，說明該藥材溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7 加樣回收率試驗

取同一已知含量的箭葉淫羊藿藥材粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，加入約等量的淫羊藿苷對照品溶液(1 mg/mL淫羊藿苷)，按2.6.2項下方法制備溶液，進行含量測定，其6份供試品的回收率范圍為94.29%～98.10%，平均回收率為96.51%，RSD值為1.6%，說明該方法準確度良好。

2.6.8 樣品含量測定

取箭葉淫羊藿藥材樣品，分別按2.6.2項下方法制備供試品溶液，在270 nm處測定其吸光度，采用標準曲線法，計算干燥品藥材中總黃酮的含量。

2.7 統(tǒng)計方法

16批箭葉淫羊藿藥材葉片占比、葉柄占比、顏色、水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總黃酮含量測定結果見表2，采用SPSS23.0軟件進行主成分分析，系統(tǒng)聚類分析和K-均值聚類分析。

表2 箭葉淫羊藿相關指標測定結果(n=3)Tab.2 Measurement results of related indexes of Epimedium sagittatum(n=3)

續(xù)表2

2.7.1 主成分分析

采用SPSS23.0軟件對16批箭葉淫羊藿藥材各指標進行主成分分析，根據(jù)不同主成分的貢獻率及線性組合的相關系數(shù)，通過指標權重歸一化，得到各項指標綜合得分系數(shù)與指標權重，結果見表3。由結果可知，葉片占比、醇溶性浸出物含量和總黃酮含量的指標權重占比較大，為主要的影響因素。

表3 指標權重分析結果Tab.3 Results of index weight analysis

2.7.2 系統(tǒng)聚類分析

根據(jù)主成分分析的結果，以葉片占比、醇溶性浸出物含量和總黃酮含量為指標，采用SPSS23.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖1。由圖可知，各批次的一等、二等和三等之間基本可以有效、有規(guī)律的聚為一類，說明各批次的相同等級之間相似性比較大。

圖1 系統(tǒng)聚類分析結果Fig.1 System cluster analysis results

2.7.3 K-均值聚類分析

根據(jù)主成分分析和系統(tǒng)聚類分析的結果，以葉片占比、葉柄占比、顏色、水溶性浸出物、醇溶性浸出物和總黃酮含量進行K-均值聚類分析，結果見表4。由結果可知，除統(tǒng)貨外將箭葉淫羊藿藥材分成三類，第一類箭葉淫羊藿各方面的指標優(yōu)于第二類箭葉淫羊藿，第二類優(yōu)于第三類。

表4 K-均值聚類最終聚類中心Tab.4 Final cluster centers of K-means clustering

3 結論與討論

3.1 結論

根據(jù)箭葉淫羊藿樣品K-均值聚類分析結果，以葉片、葉柄占比，顏色，總黃酮含量為重要指標，水分、浸出物含量為對應指標，將箭葉淫羊藿藥材分為一等、二等、三等和統(tǒng)貨。結果見表5。

表5 箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級劃分結果Tab.5 Grading results of Epimedium sagittatum medicinal materials

3.2 討論

《中藥材商品規(guī)格等級(226)種》中按照傳統(tǒng)分級方法，即葉片占比、碎葉占比和色澤將箭葉淫羊藿分為一等、二等和統(tǒng)貨，本文在此基礎上，與現(xiàn)代質(zhì)量控制指標相結合，測定水分、浸出物、總黃酮含量，旨在探究外在指標與內(nèi)在指標的相關性以及按照傳統(tǒng)的分級方法進行該藥材等級劃分是否合理。由SPSS23.0數(shù)據(jù)分析，可知外在指標和內(nèi)在指標有相關性，并且呈正相關，說明傳統(tǒng)分級方法具有合理性。通過外在指標和內(nèi)在指標相結合制定箭葉淫羊藿藥材商品規(guī)格等級質(zhì)量評價方法，既是對原有商品規(guī)格的傳承，也是一種現(xiàn)代補充，滿足了市場的變化和需求，可以有效控制箭葉淫羊藿藥材的質(zhì)量，制定的質(zhì)量評價方法更加科學、全面。

目前，基于性狀-成分-藥效模式評價中藥材的商品規(guī)格等級已是很多研究者認可的方法，陳虹宇對羌活不同商品規(guī)格抗炎、鎮(zhèn)痛藥效進行對比，研究結果表明，不同商品規(guī)格的羌活藥材抗炎、鎮(zhèn)痛效果有差異，蠶羌和疙瘩羌的抗炎鎮(zhèn)痛效果比竹節(jié)羌、尾羌的效果好[15]；曹旭林按照傳統(tǒng)分級方法，以天冬藥材外觀性狀指標顏色、斷面等將天冬藥材分為一等、二等和三等，研究不同等級天冬藥材止咳、祛痰作用強弱，發(fā)現(xiàn)一等品較三等品止咳祛痰作用顯著[16]。然而，箭葉淫羊藿藥材不同等級之間是否存在藥效學差異，還有待進一步研究。