楊 陽,嚴(yán)采馨,林翠婷,黃清華,張樂琦,鄭 強(qiáng),吳 婷,龐建新*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市婦幼保健院,中國廣東 佛山 528000;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,中國廣東 廣州 510515)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是由嘌呤代謝和腎小管重吸收失衡引發(fā)的機(jī)體尿酸(uric acid,UA)過度積聚[1]。長期HUA是誘發(fā)多種并發(fā)癥以及導(dǎo)致原有疾病惡化的重要因素。臨床研究顯示,HUA是心肌肥厚發(fā)生的風(fēng)險因素[2]。在合并心臟疾病的風(fēng)險中,血尿酸水平與心衰的發(fā)病風(fēng)險及死亡結(jié)局顯著相關(guān)[3]。大量文獻(xiàn)顯示,HUA與慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[4～6],而在本就患有CKD的患者中,HUA是導(dǎo)致全因死亡的獨(dú)立危險因素[7]?！吨袊吣蛩嵫Y與痛風(fēng)診療指南(2019)》明確指出,降尿酸治療仍然是HUA的首要處理方案[8]。當(dāng)前,我國降尿酸藥物主要包括以抑制嘌呤代謝為主的別嘌醇(allopurinol,AP)和非布司他,以及以抑制機(jī)體對尿酸重吸收為主的苯溴馬隆,藥物品種供選擇性極其有限。而基于當(dāng)前指南、專家共識以及臨床研究數(shù)據(jù),在合并其他系統(tǒng)疾病時,可供選擇的降尿酸藥物范圍進(jìn)一步縮小。

近期,我們發(fā)現(xiàn)一種天然產(chǎn)物黃芩素(baicalein,BAL)具有良好的降尿酸效果,其體內(nèi)效果與經(jīng)典降尿酸藥物AP相似,其作用機(jī)理主要是通過抑制尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(urate transporter 1,URAT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9(glucose transporter 9,GLUT9)的表達(dá)與活性,從而抑制腎小管對尿酸的重吸收,繼而起到降尿酸作用[9]。BAL是從雙子葉唇形科植物黃芩的干燥根部中提取分離出來的一種黃酮類化合物。在以往的研究中,其由于出色的抗炎、抗氧化能力,被報(bào)道在心血管疾病、糖脂代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有良好的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用[10～12]。而作為一種有潛力的降尿酸藥物,BAL對HUA相關(guān)并發(fā)癥的影響尚未評估。本文使用昆明小鼠,利用氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤建立連續(xù)8周的HUA模型,觀察BAL對心臟以及腎臟并發(fā)癥的影響,以為后期BAL在HUA合并心腎疾病的研究及應(yīng)用提供有效信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

昆明小鼠,雄性,4～5周齡,體重(20±2)g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2021-0041,飼養(yǎng)條件:(23±2)℃、相對濕度50%～80%、每天12 h日光燈照射。本研究已通過南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。氧嗪酸鉀(純度≥98%)、BAL(純度≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;次黃嘌呤(純度99%)購自上海麥克林生化科技有限公司;AP(純度98%)購自美國Sigma公司;多聚甲醛固定液(paraformaldehyde,PFA)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;尿酸測試試劑盒購自美國BioAssay Systems公司。

1.2 藥物配置

所有造模試劑和干預(yù)藥物均使用0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMCNa)作為溶劑配置。氧嗪酸鉀母液的配置濃度為35 mg/mL,次黃嘌呤母液的配置濃度為45 mg/mL,BAL母液的配置濃度為5 mg/mL,AP母液的配置濃度為0.5 mg/mL。所有造模試劑和干預(yù)藥物在給藥前需要超聲以使藥物均勻分散在溶劑中。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)和分組

24只昆明小鼠隨機(jī)分為4組:空白組(Blank)、HUA 模型組(HUA)、BAL 干預(yù)組(BAL)、AP 干預(yù)組(AP)。每日上午9:00進(jìn)行藥物干預(yù)以及造模,藥物干預(yù)在造模前1 h進(jìn)行。BAL組給予50 mg/kg BAL灌胃,AP組給予5 mg/kg AP灌胃,空白組和HUA組給予等體積CMC-Na溶劑。造模過程中,除空白對照組外,所有動物給予350 mg/kg氧嗪酸鉀腹腔注射以及450 mg/kg次黃嘌呤灌胃,空白組給予等體積CMC-Na溶劑。連續(xù)8周后進(jìn)行多普勒超聲,分析心臟功能,隨后使用頸椎脫臼的方法處死小鼠,取血液和相關(guān)組織進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 心臟多普勒超聲分析

所有小鼠于8周給藥周期結(jié)束后行多普勒超聲檢查。超聲前,小鼠禁食不禁水8 h,使用剃毛刀剔除前胸鼠毛,提前10 min腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠。在短軸模式下測量舒張期和收縮期的左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall,LVAW)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall,LVPW)以及左心室內(nèi)徑(left ventricular internal diameter,LVID)。

1.5 血漿分離及尿酸濃度測定

所有小鼠于處死前從眼眶后靜脈叢采血,血液采集至1.5 mL肝素鈉預(yù)浸潤過的離心管中,使用3 000g離心力于4℃離心10 min,分離上清。上清液中的尿酸濃度使用尿酸測試試劑盒測定。根據(jù)試劑盒說明書,使用96孔板,樣品孔中每孔加入2 μL的血清樣品以及200 μL的混合測試液,對照孔中加入2 μL空白溶液、10 mg/dL的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及200 μL的混合測試液,使用外標(biāo)法對尿酸濃度進(jìn)行計(jì)算。

1.6 組織固定及病理分析

小鼠處死后,分離心臟和腎臟組織,稱重后迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有4%PFA的離心管中,固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋。將包埋組織切成4 μm厚的薄片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和馬松(Masson)染色,使用蔡司顯微鏡明場成像模式下拍攝成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有柱狀圖采用GraphPad Prism 8.0繪制,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。多組間比較采用單因素方差分析,P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組相比的顯著性分析結(jié)果使用#表示,#:P≤0.05;##:P≤0.01;###:P≤0.001。與模型組相比的顯著性分析結(jié)果使用*表示,*:P≤0.05;**:P≤0.01;***:P≤0.001。ns:P＞0.05,無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 BAL降低HUA小鼠的尿酸水平

在之前的研究中,我們雖然發(fā)現(xiàn)BAL具有一定的降尿酸作用,但是其長期降尿酸效果并未考察。在本實(shí)驗(yàn)中,我們在連續(xù)干預(yù)及造模后,分別檢測第2周短期和第8周長期用藥后血漿中的尿酸濃度,結(jié)果表明,在第2周時,BAL表現(xiàn)出良好的降尿酸效果,與HUA組呈現(xiàn)出顯著性差異,與陽性藥物AP的趨勢一致(圖1A);在第8周時,BAL組依然呈現(xiàn)出降尿酸作用,其作用趨勢亦與AP一致,但由于長期實(shí)驗(yàn)的個體性差異,其與HUA組無顯著性差別(圖1B)。這說明BAL在短期和長期使用過程中均具有降尿酸作用。

圖1 BAL對血漿尿酸濃度的影響(A)造模及給藥干預(yù)2周末時的血漿尿酸濃度;(B)造模及給藥干預(yù)8周末時的血漿尿酸濃度。Fig.1 The influence of BAL on the concentration of plasma uric acid(A)The plasma uric acid concentration after 2-week modeling and pharmacological intervention;(B)The plasma uric acid concentration after 8-week modeling and pharmacological intervention.

2.2 BAL改善HUA造成的小鼠心功能下降

HUA是心肌肥厚、心衰發(fā)生和不良結(jié)局的重要危險因素。在8周干預(yù)及造模結(jié)束時,我們使用多普勒超聲對左心室進(jìn)行檢測(圖2A)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明,BAL能夠顯著性改善HUA誘導(dǎo)的舒張期左室前壁增厚(圖2B),對收縮期左室前壁增厚輕微改善但無顯著性意義(圖2C),減少舒張期左室后壁厚度(圖2D),對收縮期左室后壁厚度無顯著性影響(圖2E),改善由室壁增厚引起的舒張期左心室內(nèi)徑減少(圖2F),對收縮期左心室內(nèi)徑幾乎無影響(圖2G)。BAL對心功能的作用與陽性藥物AP一致。這說明,BAL可以改善長期HUA引起的舒張期心室壁增厚,從而改善心功能。

圖2 BAL對多普勒心超參數(shù)的影響(A)M超代表圖像;(B)舒張期左室前壁厚度;(C)收縮期左室前壁厚度;(D)舒張期左室后壁厚度;(E)收縮期左室后壁厚度;(F)舒張期左室內(nèi)徑;(G)收縮期左室內(nèi)徑。Fig.2 The influence of BAL on Doppler echocardiographic parameters(A)The representative M-mode images;(B)LVAW in diastolic stage;(C)LVAW in systolic stage;(D)LVPW in diastolic stage;(E)LVPW in systolic stage;(F)LVID in diastolic stage;(G)LVID in systolic stage.

2.3 BAL改善HUA造成的小鼠心肌病理改變

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BAL對HUA小鼠心臟的影響,對各組處死后的小鼠心臟進(jìn)行病理染色并拍照。HE染色結(jié)果顯示,相對于空白組,HUA模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大且排列紊亂,細(xì)胞核深染(圖3A)。Masson染色結(jié)果顯示,相對于空白組,HUA模型組小鼠存在明顯的間質(zhì)纖維化現(xiàn)象(圖3B)。而BAL干預(yù)可以明顯改善以上病理改變,其改善作用與陽性藥物AP一致。這說明BAL可以改善長期HUA引起的心肌病理改變。

圖3 BAL對HUA誘導(dǎo)心肌病理的改善(A)HE染色;(B)Masson染色。標(biāo)尺=20 μm。Fig.3 The ameliorative effect of BAL on HUA induced myocardial histopathological changes(A)HE staining;(B)Masson staining.Scale bar=20 μm.

2.4 BAL無法改善HUA引起的小鼠腎功能變化

慢性腎病是HUA最常見的并發(fā)癥,我們在處死小鼠后以腎體比初步評估了BAL對HUA下腎臟的影響。結(jié)果顯示,BAL無法改善HUA誘導(dǎo)的腎體比升高,甚至有略微升高的趨勢,這與陽性藥物AP的趨勢相反(圖4A)。我們進(jìn)一步檢測了血清中肌酐和尿素的水平,結(jié)果顯示,各組肌酐水平變化不明顯(圖4B);在血清尿素的改變上,由于個體差異過大,整體無顯著性意義,但陽性藥物AP顯示出降低尿素的趨勢,BAL的這種趨勢不明顯(圖4C)。這說明BAL可能對長期HUA引起的腎臟損傷無效。

圖4 BAL對HUA下腎功能的影響(A)腎體比;(B)血清肌酐水平;(C)血清尿素水平。Fig.4 The influence of BAL on renal function(A)The ratio of kidney mass(KW)to body weight(BW);(B)The serum creatinine levels;(C)The serum urea levels.

2.5 BAL無法改善HUA引起的小鼠腎臟病理變化

在進(jìn)一步的研究中,我們采用HE染色對小鼠腎臟進(jìn)行了病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示,相對于空白組,HUA模型組中腎小球出現(xiàn)基膜增厚,而BAL處理組并未緩解這一現(xiàn)象,陽性藥物AP處理組改善了這一現(xiàn)象(圖5A)。在腎小管中,空白組和AP組均顯示出良好的管型和排列,而HUA和BAL組則表現(xiàn)為色澤發(fā)白、腎小管擴(kuò)張、顆粒狀變性,并出現(xiàn)蛋白管型和紅細(xì)胞管型(圖5B)。這進(jìn)一步說明,BAL對長期HUA引起的腎臟損傷無效。

圖5 BAL對HUA下腎臟病理的影響(A)腎小球HE染色;(B)腎小管HE染色。標(biāo)尺=20 μm。Fig.5 The influence of BAL on kidney histopathological changes(A)HE staining of glomeruli;(B)HE staining of renal tubules.Scale bar=20 μm.

3 討論

隨著生活水平的提高,我國HUA的發(fā)病率在不同人群中呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢[13～15]。大量HUA患者本身合并有其他器質(zhì)性疾病,且HUA本身亦可導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生及惡化。因此,臨床選擇降尿酸藥物需同時兼顧其對并發(fā)癥的影響。心臟和腎臟疾病是HUA的常見并發(fā)癥。臨床數(shù)據(jù)顯示,血清尿酸每增加1 mg/dL,心衰發(fā)生率增加19%,同時,心衰患者死亡率增加4%[3];腎功能損傷風(fēng)險增加7%至11%[16]。我國常用降尿酸藥物的種類極其有限,包括黃嘌呤氧化酶抑制劑AP、非布司他以及尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑苯溴馬隆。而且,《中國高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南(2019)》明確說明,上述藥物在合并一些并發(fā)癥時是限制使用的,如AP禁用于CKD 5期;非布司他慎用于合并心腦血管疾病的老年人;苯溴馬隆禁用于腎結(jié)石患者,慎用于合并慢性肝病患者[8]。故對于本就合并心臟或腎臟疾病的患者,降尿酸藥物的可供選擇性進(jìn)一步降低。我們前期通過對傳統(tǒng)中藥的挖掘發(fā)現(xiàn),BAL具有體內(nèi)降尿酸的效果[9]。本研究以昆明小鼠為研究對象,使用氧嗪酸鉀和次黃嘌呤聯(lián)合造模構(gòu)建長期慢性HUA模型,進(jìn)一步考察了長期使用BAL對心臟和腎臟的影響。

2021年發(fā)表于Cardiology Journal的專家共識指出,僅推薦AP為HUA合并心血管疾病的一線降尿酸治療藥物[17],這與當(dāng)前臨床試驗(yàn)中非布司他的心血管毒性的爭議性[18～19],以及苯溴馬隆在治療HUA合并心衰患者中血流動力學(xué)改善效果不佳[20]相關(guān)。2018年發(fā)表在The New England Journal of Medicine的大型隨機(jī)對照研究表明,相對于AP,使用非布司他降尿酸的全因死亡及心血管死亡率均顯著上升[18],而2021年發(fā)表于Lancet的研究結(jié)果并不支持這一結(jié)論,其指出非布司他心血管不良事件的發(fā)生不劣于AP[19]。在一項(xiàng)包含82例HUA合并慢性心衰患者的研究中,苯溴馬隆雖然可以顯著性降低血清尿酸水平,但并未改善HUA合并慢性心衰患者的腦鈉肽、左室射血分?jǐn)?shù)以及心肌室壁厚度[20]。在我們的研究中,BAL能夠有效改善心功能,減輕重構(gòu)導(dǎo)致的左室壁肥厚現(xiàn)象,其作用效果與陽性藥物AP相當(dāng),這為HUA合并心臟疾病的降尿酸策略提供了新的選擇。

心肌細(xì)胞內(nèi)的尿酸來源于黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)介導(dǎo)的嘌呤代謝以及細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的胞外向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。我們前期研究表明,BAL可以降低XO活性,以及下調(diào)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體URAT1、GLUT9的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平[9]。研究顯示,尿酸對心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制主要基于活性氧(reactive oxygen species,ROS)相關(guān)的胰島素抵抗以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[21～22]。而BAL作為黃酮類化合物,具有良好的抗氧化作用。在異丙腎上腺素以及脂多糖引起的心肌肥厚中,BAL通過改善炎癥減少ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,從而改善心肌狀態(tài)[12,23]。我們前期的研究結(jié)果顯示,BAL可以有效改善HUA誘導(dǎo)的心肌炎癥因子聚集,以及間質(zhì)纖維化現(xiàn)象,其作用機(jī)制可能歸因于4點(diǎn):降尿酸作用[9];抑制XO從而減少胞內(nèi)尿酸生成[24];下調(diào)URAT1和GLUT9從而降低胞外尿酸的攝取[9];抗氧化作用從而減少ROS生成[12]。

CKD是HUA最常見的并發(fā)癥。腎臟負(fù)責(zé)約70%尿酸的排泄,大量尿酸通過腎小管重吸收至體內(nèi)繼續(xù)循環(huán)[25]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,在無HUA的情況下,男性CKD的患病率為3.1%,女性為3.6%,而在HUA的情況下,男性CKD的患病率為9.5%,女性為19.6%[26]。腎小管內(nèi)尿酸過量引起的上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,以及尿酸結(jié)晶,是HUA導(dǎo)致腎臟損傷的病理基礎(chǔ)[27～28]。本研究顯示,BAL可以加重HUA誘導(dǎo)的腎臟損傷,與單純的XO抑制劑AP形成鮮明對比。我們前期研究顯示,BAL可以抑制腎臟中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體水平的上升,降低血尿酸的同時升高尿液中尿酸的濃度[9]。這說明BAL降尿酸的作用機(jī)制在于減少腎小管對尿酸的重吸收,而腎小管內(nèi)長期高濃度的尿酸刺激正是CKD發(fā)生以及發(fā)展的重要因素。具有類似尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制功能的藥物苯溴馬隆,在臨床實(shí)際應(yīng)用中曾被報(bào)道可促進(jìn)尿酸性結(jié)石形成,從而導(dǎo)致急性腎損傷[29];另一個未在中國上市的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑lesinurad,也被報(bào)道在臨床中可以導(dǎo)致腎臟相關(guān)不良事件的發(fā)生[30]。以往研究提示,在使用尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑時,合并碳酸氫鈉等制劑堿化尿液可以通過減少尿酸結(jié)晶形成改善腎損傷[29,31],這一方法亦可借鑒于未來BAL的使用。

綜上所述,BAL作為降尿酸藥物長期使用時,對尿酸引起的心肌損傷及心室重構(gòu)現(xiàn)象是有改善作用的,但是會加重HUA誘導(dǎo)的腎臟損傷,在未來合并相應(yīng)并發(fā)癥的藥物研究和應(yīng)用中應(yīng)予以注意。