劉鵬飛， 李坪遙， 劉 君， 麥嘉埼， 周捷成， 梁日朗， 蔣 鋒

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院， 廣州 510225；2.廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室， 廣州 510225)

玉米是我國的主要糧食作物，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有舉足輕重的地位[1]。我國玉米播種的區(qū)域跨度和地方氣候差異較大，而高活力種子可有效減少不良環(huán)境和有害微生物對種子的影響，保證苗齊苗壯，對確保作物產(chǎn)量十分必要[2]。因此，高活力的玉米種質(zhì)資源是玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要需求。

超聲波是一種綠色無污染的物理處理手段，目前研究表明，適度超聲波處理可提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)種子萌發(fā)和生長[3-11]。黎國喜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理過的水稻種子，其促進(jìn)種子活力的效應(yīng)可以延續(xù)到水稻后期生長發(fā)育及產(chǎn)量。陳曉輝等[13]發(fā)現(xiàn)，超聲波處理可以顯著促進(jìn)玉米種子的萌發(fā)；吳海燕[14]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理不僅能促進(jìn)玉米種子萌發(fā)，而且能顯著促進(jìn)玉米植株的生長發(fā)育，提高株高、莖粗、葉長和葉寬，利于光合產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累。轉(zhuǎn)錄組廣義上指某一生理條件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合[15]。關(guān)于種子活力的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組分析已在水稻[16]、花生[17]、黃芪[18]等植物方面有相關(guān)報道?；谵D(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對玉米在高溫脅迫、鹽脅迫、根系耐旱性[19-24]等逆境條件下的基因調(diào)控及差異基因表達(dá)等方面也有一定的研究。目前，超聲波在種子活力上的研究大都集中在超聲波對種子萌發(fā)、生長發(fā)育及產(chǎn)量因素的影響，通過測定與種子活力相關(guān)的表型性狀及生理生化指標(biāo)等來揭示超聲波處理對種子活力的影響[25-27]。

目前針對超聲波促進(jìn)種子活力的機(jī)理研究較少，尤其是分子機(jī)理研究方面鮮有報道。本研究通過超聲波處理方法，對糯玉米自交系N 51種子進(jìn)行不同時長處理，分析不同處理時長對玉米種子活力的影響及規(guī)律。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析超聲波處理下玉米種子與活力相關(guān)的差異表達(dá)基因以及通過GO數(shù)據(jù)庫注釋和KEGG數(shù)據(jù)庫分析，為解析超聲波處理促進(jìn)種子活力及相關(guān)分子機(jī)理研究提供一條探究之路。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試玉米材料來源于廣州市嶺南特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室自主選育的糯玉米(ZeamaysL.sinensisKulesh)自交系N 51。選取籽粒飽滿且大小一致的種子作為試驗材料。

1.2 處理及取樣

取糯玉米種子清水浸泡12 h后放入超聲波清洗儀(KQ 3200 E型，40 kHz，150 W)中，分別處理5 min(T 1)、10 min(T 2)、15 min(T 3)，以未經(jīng)超聲波處理的玉米種子即處理0 min作為對照(ck)。處理結(jié)束后放入人工氣候箱(恒溫28 ℃，16 h光照，8 h黑暗)中進(jìn)行發(fā)芽試驗，設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)50粒。

以種子露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，從24 h后開始每隔12 h記錄種子的萌發(fā)數(shù)，直至對照組種子萌發(fā)結(jié)束。試驗過程中，篩選種子萌發(fā)率差異顯著的超聲波處理時長，并基于種子萌發(fā)差異顯著的時間點進(jìn)行取樣，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

萌發(fā)率(%)=(種子萌發(fā)數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

萌發(fā)速率為每12 h增加的萌發(fā)種子數(shù)，指標(biāo)測定3次取平均值。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

對玉米樣品進(jìn)行總RNA的提取、mRNA的富集、文庫構(gòu)建和質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后開始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析, 測序工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，留取高質(zhì)量的序列片段進(jìn)行后續(xù)分析。將留取的高質(zhì)量的序列片段與玉米的核糖體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，去除比對上核糖體的序列片段，保留未比對上的序列片段。隨后將未比對上的序列片段對比到玉米參考基因組：Zeamays.B73_RefGen_v4進(jìn)行比對分析；根據(jù)比對結(jié)果，利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達(dá)量，獲得序列的表達(dá)量數(shù)據(jù)和歸一化校正后的基因表達(dá)量FPKM值，基于各樣本表達(dá)量結(jié)果，通過PCA分析和計算樣本間pearson相關(guān)系數(shù)，考查樣品之間重復(fù)性?；诨虮磉_(dá)水平分析中得到的序列片段的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用DESeq 2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異分析，基于差異分析結(jié)果，篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因用于后續(xù)分析。利用GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因的功能和信息進(jìn)行分析和挖掘。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時長超聲波處理對玉米種子活力的影響

對不同時長超聲波處理玉米種子的萌發(fā)試驗結(jié)果表明，以0 min(ck)、5 min(T 1)、10 min(T 2) 和15 min(T 3)共4個時長對玉米種子進(jìn)行處理，各處理組的萌發(fā)率均高于ck且各處理組間萌發(fā)率具有差異，其中10 min時長處理的效果最好，萌發(fā)率最高，種子在36 h時萌發(fā)生長差異最顯著(如圖1)。ck、T 2和T 3處理下，糯玉米自交系N 51種子活力呈先上升和后下降的趨勢。

注：ck表示對照組(未進(jìn)行超聲波處理)，T 1表示超聲波處理5 min，T 2表示超聲波處理10 min，T 3表示超聲波處理15 min。圖1 玉米種子在不同超聲波時長處理下不同時間的發(fā)芽率Fig.1 The germination rate of corn seeds at different time under different ultrasonic durations

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

本試驗對ck、T 2、T 3 三個處理共9個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得大量原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)，篩選得到Clean Reads，隨后分析Clean Reads 的堿基組成及質(zhì)量分布以及評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。結(jié)果顯示，每個樣品中的Clean Reads堿基質(zhì)量為Q 20的堿基數(shù)目比例均高達(dá)97.6%以上，堿基質(zhì)量為Q 20的堿基數(shù)目比例均高達(dá)93.4%以上，各生物學(xué)重復(fù)之間QC含量差異不大，而且所有樣品的QC含量均高于56.8%，表明過濾后的Clean Reads堿基識別準(zhǔn)確度可靠，Reads質(zhì)量高，可用于下一步分析。

2.3 Clean Reads序列比對分析

為避免rRNA殘留，將Clean Reads與玉米的核糖體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，除掉比對上核糖體的Reads，獲得過濾rRNA后測序片段數(shù)(Unmapped Reads)，然后將Unmapped Reads與玉米參考基因組(Zeamays.B73_RefGen_v4)進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，測序所得數(shù)據(jù)利用率較高，有效Reads總比對率均達(dá)到89.94%以上，而且唯一比對上參考基因組的有效Reads所占比例高，均達(dá)到87.44%以上，多處比對上參考基因組的有效Reads比例很低，均不超過2.61%。同時每個樣品中至少89.90%的有效Reads均比對到外顯子區(qū)域。根據(jù)比對結(jié)果，利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達(dá)量和得到不同基因在樣本中的表達(dá)量，用于后續(xù)差異分析。

2.4 樣本相關(guān)性評估

本試驗通過計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)r來衡量樣品間的相關(guān)性，根據(jù)Z-score繪制熱圖(圖 2)對不同樣品間的生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性進(jìn)行可視化分析，結(jié)果表明玉米的9個樣品中重復(fù)之間相關(guān)性高，不同處理間相關(guān)性低，可進(jìn)行下一步分析。

2.5 差異基因篩選

36 h處理時，糯玉米自交系N 51種子萌發(fā)率在ck、T 2、T 3這3個處理間，呈先升后降的趨勢，故篩選出基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降趨勢的基因857個以及先下降后上升趨勢的基因848個，記為Cluster 1和Cluster 2(圖 3)。

2.6 差異基因功能分析

對Cluster 1基因和Cluster 2基因進(jìn)行GO功能注釋。發(fā)現(xiàn)Cluster 1基因(圖 4)在生物過程類別中注釋到21個亞類，主要注釋在細(xì)胞過程(425個)、代謝過程(401個)、單一生物過程(273個)中；在分子功能類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在結(jié)合(360個)和催化活性(314個)；在細(xì)胞組成類別中注釋到了14個亞類，主要注釋在細(xì)胞(395個)、細(xì)胞組分(388個)和細(xì)胞器(295個)中。

Cluster 2基因(圖 5)在生物過程類別中注釋到了18個亞類，主要注釋在代謝過程(428個)、細(xì)胞過程(416個)和單一生物過程(295個)中；在分子功能類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在催化活性(397個)和結(jié)合(370個)中；在細(xì)胞組成類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在細(xì)胞(338個)、細(xì)胞組分(338個)和膜(277個)中。

對Cluster 1基因和Cluster 2基因進(jìn)行GO富集分析，選取富集分析結(jié)果中FDR值最小的前20繪制GO term顯著富集柱狀圖(圖 6)，結(jié)果顯示，Cluster 1基因主要富集在葉綠體(GO：0009507)、質(zhì)體(GO：0009536)、類囊體(GO：0009579)、葉綠體部分(GO：0044434)、質(zhì)體部分(GO：0044435)、葉綠體類囊體(GO：0009534)、類囊體部分(GO：0044436)、質(zhì)體類囊體(GO：0031976)、類囊體膜(GO：0042651)和光合膜(GO：0034357)等term 中。

Cluster 2基因(圖 7)主要富集在細(xì)胞外圍(GO：0071944)、細(xì)胞外區(qū)域(GO：0005576)、質(zhì)膜(GO：0005886)、活性氧代謝過程(GO：0072593)、細(xì)胞多糖代謝過程(GO：0044264)、半纖維素代謝過程(GO：0010410)、胞間連絲(GO：0009506)、細(xì)胞結(jié)合(GO：0030054)、細(xì)胞間連接(GO：0005911)、共質(zhì)體(GO：0055044)、過氧化氫分解代謝過程(GO：0042744)、細(xì)胞壁多糖代謝過程(GO：0010383)、氧化還原過程(GO：0055114)等term中。

注：ck表示對照組(未進(jìn)行超聲波處理)；UL 1表示超聲波處理10 min；UL 2表示超聲波處理15 min。 圖2 9個玉米樣本的相關(guān)性熱圖 Fig.2 The correlation heat map of 9 corn samples

圖3 Cluster1和Cluster2基因表達(dá)模式 Fig.3 Cluster1 and Cluster2 gene expression pattern

對Cluster 1和Cluster 2基因顯著富集的term進(jìn)行共富集分析，發(fā)現(xiàn)其共同顯著富集的term數(shù)是7個(圖 8)，分別是氧化還原過程(GO：0055114)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(GO：0006979)、幼苗發(fā)育(GO:0090351)、對非生物刺激的反應(yīng)(GO：0009628)、激素水平的調(diào)節(jié)(GO：0010817)、金屬離子結(jié)合(GO:0046872)和整體-[?；d體蛋白]合成酶活性(GO:0008897)。表明超聲波處理可能引起上述基因的差異表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而影響玉米種子活力相關(guān)性狀的表達(dá)。

對Cluster 1和Cluster 2基因進(jìn)行KEGG富集分析，選取富集分析結(jié)果中FDR值最小的前20繪制KEGG顯著富集柱狀圖，富集結(jié)果分析顯示，Cluster 1(圖 9)主要注釋在光合作用(ko 00195)、蛋白質(zhì)外排(ko 03060)、類胡蘿卜素的生物合成(ko 00906)、植物的晝夜節(jié)律(ko 04712)、谷胱甘肽代謝、(ko 00480)、卟啉和葉綠素代謝(ko 00860)、硫代謝(ko 00920)、光合作用-天線蛋白(ko 00196)、泛醌和其他萜類醌的生物合成(ko 00130)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(ko 01110)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko 04075)、脂肪酸伸長率(ko 00062)、精氨酸生物合成(ko 00220)等通路中。

Cluster 2(圖 10)主要注釋在苯丙素的生物合成(ko 00940)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(ko 01110)、類黃酮生物合成(ko 00941)、氰氨基酸代謝(ko 00460)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko 04075)、亞油酸代謝(ko 00591)、淀粉和蔗糖代謝(ko 00500)、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚的生物合成(ko 00945)、代謝途徑(ko 01100)、氮素代謝(ko 00910)、磷酸肌醇代謝(ko 00562)、抗壞血酸和海藻酸鹽代謝(ko 00053)、不飽和脂肪酸的生物合成(ko 01040)和谷胱甘肽代謝(ko 00480)等通路中。

圖4 Cluster1 GO注釋分類 Fig.4 Cluster1 GO annotation classification

圖5 Cluster2 GO注釋分類Fig.5 Cluster2 GO annotation classification

圖6 Cluster1 GO富集分析Fig.6 Cluster1 GO enrichment analysis

圖7 Cluster2 GO富集分析Fig.7 Cluster2 GO enrichment analysis

對兩個趨勢基因集注釋到的KEGG通路進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)共富集到34個通路(圖 11)，分別為苯丙烷生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、黃酮類生物合成、氰氨基酸代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、代謝途徑、氮素代謝、磷酸肌醇代謝、谷胱甘肽代謝、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑-植物、精氨酸生物合成、植物與病原體的相互作用、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、醚脂質(zhì)代謝、氨基酸的生物合成、泛醌和其他萜類醌的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、過氧化物酶體、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、蛋白質(zhì)出口、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、晝夜節(jié)律-植物、光和生物中的碳固定、乙醛酸和二羧酸酯代謝、甘油酯代謝、吞噬體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。表明響應(yīng)超聲波處理的差異基因通過影響糯玉米自交系種子的上述通路來促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子活力。

圖9 Cluster1 KEGG富集分析Fig.9 Cluster1 KEGG enrichment analysis

圖8 Cluster 1和Cluster 2共富集的GO termFig.8 GO term co-enriched by Cluster 1 and Cluster 2

3 討論與結(jié)論

采用超聲波處理玉米種子并對顯著影響種子活力的處理進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，該數(shù)據(jù)反映了經(jīng)超聲波處理后玉米種子萌發(fā)生長過程中基因差異表達(dá)情況，通過對差異基因的表達(dá)和功能分析，探索響應(yīng)超聲波處理后種子活力相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，為超聲波對玉米種子活力的影響以及其相關(guān)分子機(jī)制的研究提供一定的參考。本研究通過對糯玉米自交系N 51進(jìn)行不同時長的超聲波處理，發(fā)現(xiàn)超聲波處理5 min、10 min和15 min的種子萌發(fā)率均高于未進(jìn)行超聲波處理，其中10 min和15 min差異達(dá)到顯著水平，這與陳曉輝[13]和吳海燕[14]的研究結(jié)果相似，表明超聲波處理可以提高玉米種子的活力。

轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選得到兩個與種子萌發(fā)率在不同處理中呈現(xiàn)出趨勢一致的共表達(dá)模式基因集Cluster 1(857個基因)和Cluster 2(848個基因)。通過GO功能注釋和共富集分析，得出Cluster 1和Cluster 2基因集注釋到生物過程、分子功能和細(xì)胞組成三個大類的共92個亞類，分別富集在氧化還原過程、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、幼苗發(fā)育、對非生物刺激的反應(yīng)、激素水平的調(diào)節(jié)、金屬離子結(jié)合和整體-[?；d體蛋白]合成酶活性這7個過程中。研究表明，植物激素在種子萌發(fā)過程中起到顯著作用[28-29]，本研究結(jié)果與之相似。對Cluster 1和Cluster 2基因集進(jìn)行KEGG富集分析表明，它們參與了與代謝、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理相關(guān)的34條通路，其中與代謝相關(guān)的通路，如苯丙烷生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、淀粉和蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝、氨基酸的生物合成，已在小麥[30-31]和水稻[32]相關(guān)研究中表明與提高種子活力相關(guān)；與細(xì)胞相關(guān)的通路中的過氧化物酶體已在玉米[33]和擬南芥[34]中被證明可有效促進(jìn)根的伸長和發(fā)育。這些與本研究中超聲波處理促進(jìn)種子活力表達(dá)所影響的主要通路結(jié)果一致，表明這些通路在調(diào)控種子活力方面發(fā)揮了重要的作用。本研究對超聲波處理影響種子萌發(fā)時期的部分差異基因進(jìn)行探索，而超聲波處理對玉米苗期生長、抗逆能力、生產(chǎn)潛力等多方面影響的相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控還需要進(jìn)一步深入挖掘。

圖10 Cluster2 KEGG富集分析Fig.10 Cluster2 KEGG enrichment analysis

圖11 Cluster1和Cluster2共富集的通路 Fig.11 Cluster1 and Cluster2 co-enrichment pathways