王幼珊 王曉燕 張淑彬 石瑤瑤 蓋京蘋 殷曉芳 邢禮軍

( 北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京，100097) ( 臺(tái)州學(xué)院) ( 北京市農(nóng)林科學(xué)院) ( 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)) ( 北京市農(nóng)林科學(xué)院)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌屬球囊菌門(Glomeromycota)，是自然界與植物共生關(guān)系最古老也最為密切的微生物之一，超過80%的陸生植物可與AM真菌形成互利共生關(guān)系，為宿主植物提供水分和礦質(zhì)養(yǎng)分[1-2]。隨著形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，AM真菌分類系統(tǒng)也日趨完善。Schuler(http://schuessler.userweb.mwn.de/amphylo/)和Redecker et al.[3]公布的分類系統(tǒng)中已發(fā)現(xiàn)AM真菌近300種。中國已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的有147種，其中包括13個(gè)新種[4]。

日喀則位于我國西藏自治區(qū)西南部，喜馬拉雅山脈中段以北，岡底斯山脈和念青唐古拉山之間，地形復(fù)雜多變，海拔差異較大，平均海拔4 000 m以上[5]。林芝位于西藏自治區(qū)東南部，氣候獨(dú)特，海拔落差大，平均海拔3 000 m左右。西藏地區(qū)物種資源豐富，被國際環(huán)保組織劃入全球34個(gè)物種最豐富且受到威脅最大的生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)。該地區(qū)蘊(yùn)藏著豐富的AM真菌資源。研究表明，AM真菌對(duì)西藏地區(qū)植被和農(nóng)作物(例如青稞)的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用[6-8]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與孢子擴(kuò)繁

以西藏日喀則地區(qū)白朗縣和江孜縣為調(diào)查區(qū)域，采集馬藺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)、血滿草(SambucusadnataWall. ex DC.)和小麥(TriticumaestivumL.)根際土壤。采樣時(shí)，去除土壤表面枯枝落葉，采集地表以下25 cm范圍內(nèi)的土壤1 kg放入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，以高粱為宿主進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)、單孢擴(kuò)繁[11]獲得純種AM真菌菌劑。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

取培養(yǎng)的純種AM真菌菌劑10 g，通過濕篩傾析法篩取孢子[11]，從每個(gè)菌種篩取的孢子中挑取50～100個(gè)，在體視顯微鏡下以水浮載液觀察孢子形態(tài)。然后分別將一半數(shù)量的孢子放入PVLG和PVLG+Melzer’s試劑中制成裝片，在光學(xué)生物顯微鏡下進(jìn)行孢子顯微結(jié)構(gòu)觀察，記錄孢子顏色、大小、壁層結(jié)構(gòu)和連孢菌絲等形態(tài)特征。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

從每種AM真菌菌劑分離的孢子中取10個(gè)，放入裝有體積分?jǐn)?shù)2%氯胺-T的1.5 mL離心管中消毒1 min，然后用滅菌的蒸餾水清洗5次后將孢子轉(zhuǎn)移到含有14 μL TE buffer的離心管中，用無菌移液器吸頭將孢子搗碎，離心后取上清液即獲得孢子總DNA。先后分別用引物ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’)與NDL22(5’TGGTCCGTGTTTCAAGACG3’)和LR1(5’GCATATCAATAAGCGGAGGA3’)與FLR2(5’GTCGTTTAAAGCCATTACGTC3’)進(jìn)行巢式PCR對(duì)28S rRNA部分區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[12]。

第1次PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1/NDL22，包括5.8S rDNA和部分28S rDNA，片段長(zhǎng)度約1 300 bp。反應(yīng)體系為20 μL，包含10×PCR buffer(包含Mg2+)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，Takara Taq酶(5 U·L-1)0.1 μL，DNA模板1.0 μL，引物ITS1(10 mmol·L-1)和NDL22(10 mmol·L-1)均為0.5 μL，ddH2O 14.3 μL。反應(yīng)條件：94 ℃,4 min;(94 ℃,30 s;58 ℃,1 min;72 ℃,1 min)30循環(huán);72 ℃,10 min。第1次PCR產(chǎn)物稀釋10倍用于第2次PCR的模板。第2次PCR采用引物L(fēng)R1/FLR2進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與第1次PCR相同。

第2次PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖膠檢測(cè)后送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。所得序列經(jīng)SeqMan校對(duì)和拼接，然后提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取登錄號(hào)。在NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLAST獲得相似度較高的序列用MUSCLE[13]軟件對(duì)本研究測(cè)序所得序列與已知序列對(duì)齊，用MEGA X[14]通過ML分析尋找最優(yōu)模型后構(gòu)建最大似然進(jìn)化樹。用Bootstrap 1 000次來評(píng)估分值的可靠性。Dominikia屬和Rhizophagus屬目前分別有12個(gè)和5個(gè)物種的序列可與本研究所測(cè)區(qū)域比對(duì)，用于構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度多氏囊霉Dominikia indica Baszk., Chwat & Kovács(2015)

≡GlomusindicumBaszk., Wubet, Harikumar Botany 88(2):132(2010)

孢子形成于土壤中，著生在疏松的根外菌絲上(圖1A)，孢子透明至亮黃色，球形至近球形，直徑35 μm。孢子壁兩層(L1和L2，圖1A，圖1C)，黏在一起，外層(L1)黏質(zhì)，透明，厚1.0 μm，在Melzer’s試劑中染成粉紅色到紅色(圖1B)，成熟孢子中易脫落；內(nèi)層(L2)單一壁或?qū)訝畋?，亮黃色，厚1.5～3.0 μm。連孢菌絲透明，圓柱形到小漏斗形，有時(shí)彎曲，連點(diǎn)寬3.0～6.1 μm，偶爾有隔，由孢子的兩層壁延伸形成(圖1C)。

樣本信息：標(biāo)本編號(hào)BGC XZ10，從西藏日喀則市江孜縣年堆鄉(xiāng)卓薩村(28°52′14.25″N,89°41′22.61″E，海拔4 101 m)馬藺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)根圍土中分離獲得。

2.2 異形根孢囊霉Rhizophagus irregularis C. Walker & Schuessler(2010)

≡GlomusirregulareBaszk., Wubet, Renker & Buscot, Mycotaxon 106:252.2008

孢子果未見。孢子聚集分布在根內(nèi)(圖2A)或土壤中，有時(shí)單生于土壤中；透明、乳白、淺黃至黃棕色。球形，近球形，卵球形，長(zhǎng)圓形或不規(guī)則，直徑70～145 μm(連孢菌絲方向)(圖2B)。孢子壁3層(L1，L2和L3)(圖2C，2D)，L1為最外層，半永久壁，透明，0.5～1.5 μm厚，成熟時(shí)脫落，不與Melzer’s試劑發(fā)生染色反應(yīng)；L2半永久壁，透明，當(dāng)幼孢子完整時(shí)，黏附于L1上，1.0～4.5 μm厚，隨著孢子成熟和變老，該層與L3分開，與L1同時(shí)降解，成熟的孢子中，L1和L2消失或殘余；最內(nèi)層為L(zhǎng)3，永久層狀壁，淡黃色到黃棕色，1.8～5.0 μm厚，可見分開的亞層，在Melzer’s試劑中染成粉色或紅色(圖2D)。連孢菌絲透明至淺黃，圓柱形或小漏斗形，有時(shí)溢縮或彎曲，連點(diǎn)寬8.0～13 μm，敞開，偶爾有隔(圖2C)，連孢菌絲的3層壁(HL1，HL2和HL3)由孢子的3層壁延伸形成(圖2C，2D)。

樣本信息：樣本BGC XZ11B從西藏日喀則市白朗縣巴扎鄉(xiāng)扎西崗村(29°9′57.96″N,89°12′19.94″E，海拔3 880 m)小麥(TriticumaestivumL.)根圍土中分離。樣本BGC XZ04B從西藏林芝市米林縣索松村(29°36′53.57″N,94°55′19.34″E，海拔3 190 m)血滿草(SambucusadnataWall. ex DC)根圍土中分離。

A為在PVLG中隨機(jī)分布的孢子和孢子壁層；B為孢子與連孢菌絲在Melzer’s試劑中的反應(yīng)；C為孢子壁層及連孢菌絲。

A為體視鏡下水浮載液中的孢子；B為PVLG中隨機(jī)分散的孢子；C為孢子壁層(L1,L2和L3)及連點(diǎn)處的隔S(Septum)；D為Melzer’s試劑中的孢子壁層結(jié)構(gòu)(L1,L2和L3)和連孢菌絲壁層結(jié)構(gòu)(HL1,HL2和HL3)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)。樣本BGC XZ10、BGC XZ11B、BGC XZ04B-216、BGC XZ04B-217和BGC XZ04B-218登錄號(hào)分別為MT936436、MT936437、MW007887、MW007888、MW007889。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，樣本BGC XZ10與Dominikiaindica、D.bernensis和D.minuta聚為一支，具有較高的支持率(99%)(圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，鑒定為D.indica。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明樣本BGC XZ11B、BGC XZ04B-216、BGC XZ04B-217和BGC XZ04B-218與Rhizophagusirregularis聚為一支，支持率為98%(圖4)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定為R.irregularis。

3 結(jié)論與討論

印度多氏囊霉Dominikiaindica分離于印度南部喀拉拉邦濱海沙地白苞猩猩草(Euphorbiaheterophylla)和非洲東北部的厄立特里亞國萵苣(Lactucasativa)的根際土中。首次發(fā)現(xiàn)被命名為Glomusindicum[15]。之后在Dominikia屬的介紹中更名為D.indica[16]。以大葉車前(Plantagolanceolata)為宿主，D.indica單孢培養(yǎng)物可形成泡囊—叢枝結(jié)構(gòu)[15]。此外，該種還分布于美國、愛沙尼亞和澳大利亞，分布范圍較廣泛，但是在中國的分布是首次報(bào)道。

D.indica形態(tài)特征與微叢球囊霉Glomusmicroaggregatum、伯爾尼多氏囊霉Dominikiabernensis和無色多氏囊霉Dominikiaachra相似。但是，G.microaggregatum的孢子壁不會(huì)被Melzer’s試劑染色；D.bernensis的孢子形成密集的孢子果，并且連孢菌絲有隔；D.achra孢子壁有3層(L1,L2和L3)，其中L1和L3能被Melzer’s染色，并且L3受到壓力會(huì)與L2分離開。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中，D.indica與D.minuta聚為一支，但是兩者形態(tài)差異較大。D.indica孢子透明至亮黃色，簇狀著生，外層孢子壁會(huì)被染成粉紅色至紅色，而D.minuta孢子透明，單生或聚集生長(zhǎng)在根上，孢子壁較薄且不會(huì)被染色[17]。

異形根孢囊霉Rhizophagusirregularis首次于1993年在波蘭西北部海岸沙丘上的蜂斗菜(Petasitesspurius)根圍土中發(fā)現(xiàn)，2008年由Baszkowski等人首次命名為Glomusirregulare[18]，該種形態(tài)上與根內(nèi)根孢囊霉Rhizophagusintraradices非常相似。但是R.irregularis孢子壁的L1不與Melzer’s試劑發(fā)生染色反應(yīng)，L3在Melzer’s試劑中被染成粉色或紅色；而R.intraradices孢子壁L1在Melzer’s試劑中染成粉色或紅色，L3在Melzer’s試劑中無反應(yīng)。

序列的登錄號(hào)位于圓括號(hào)內(nèi)；系統(tǒng)發(fā)育樹分支點(diǎn)處的數(shù)字表示置信度(>50%)。

序列的登錄號(hào)位于圓括號(hào)內(nèi)；系統(tǒng)發(fā)育樹分支點(diǎn)處的數(shù)字表示置信度(>50%)。

R.intraradices在舊分類系統(tǒng)為Glomusintraradices[19]。由于這兩個(gè)種形態(tài)相似，有一段時(shí)間被混淆，后因R.irregularis在2013年首次被全基因組測(cè)序[20]，國內(nèi)一些研究者在用新分類系統(tǒng)發(fā)表文章時(shí)直接將試驗(yàn)所用菌種G.intraradices寫成R.irregularis，這是完全錯(cuò)誤的。R.intraradices和R.irregularis已被Schuler和Walker于2010年證明為是兩個(gè)不同的種[21]。