郭東光，陳明艷，馮春花，王 豐，卞爽麗,2，李文明，王凱露，呂薇薇，鄭文珺，陳子怡，孫國鵬，李雪華，田金河，李 鵬，朱艷平，岳 鋒，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院/動物疫病分子診斷河南省工程實驗室，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450000；3.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，河南新鄉(xiāng) 453000)

近年來，隨著我國對傳統(tǒng)“瘦肉精”監(jiān)管力度的不斷加強，一些新型“瘦肉精”藥物可能被非法用于畜禽養(yǎng)殖，當(dāng)被動物機體攝入后，同樣導(dǎo)致畜產(chǎn)品(肌肉、肝臟、腎臟等器管)中有較高的殘留量。因“瘦肉精”是苯乙醇胺類化合物，與機體分泌的多巴胺(dopamine)、去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)及腎上腺素(adrenaline,A)等兒茶酚胺類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，會對人體造成嚴(yán)重危害，如組織器官的損傷，心悸、頭暈、乏力、惡心嘔吐等中毒現(xiàn)象[1]。

齊帕特羅(zilpaterol,ZIL)是β2腎上腺素受體(β2-adrenergic receptors,β2AR)激動劑的一種，與萊克多巴胺(ractopamine,RAC)和克倫特羅(clenbuterol,CLB)一樣同屬于“瘦肉精”類，其分子式為C14H19N3O2，分子質(zhì)量為297.784 u，熔點為123℃～126℃，外觀呈白色或類白色結(jié)晶性粉末(圖1)[2-3]。作為一種新型瘦肉精，ZIL其主要作用也是促進蛋白質(zhì)合成和肌肉生長，減少脂肪組織的沉淀。當(dāng)作為飼料添加劑飼喂動物后能明顯增加動物的肌肉/脂肪比，顯著提高飼養(yǎng)動物胴體瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率，明顯改善肉的品質(zhì)和降低動物的養(yǎng)殖成本。但相比于傳統(tǒng)“瘦肉精”CLB，ZIL因其毒性相對較弱，其藥效僅相當(dāng)于CLB的十分之一，卻比RAC更有效。因此，ZIL可能迅速發(fā)展成為動物飼料添加劑CLB的替代品，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[4]。所以，建立有效、快速、簡便、靈敏的食品污染物檢測方法是當(dāng)務(wù)之急。

圖1 齊帕特羅的分子結(jié)構(gòu)

很多國家已經(jīng)明令禁止使用ZIL，但美國、加拿大、墨西哥和南非曾批準(zhǔn)在牛上使用ZIL，給全世界食品安全帶來嚴(yán)重威脅[5-6]。目前，歐盟國家對ZIL使用和動物組織中殘留方面的研究相對較多，儀器檢測方法主要涉及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid liquid-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[7-9]。在快速和高通量篩選方面，因免疫學(xué)檢測技術(shù)具有高靈敏度、高通量、重現(xiàn)時間快等優(yōu)點，是當(dāng)前檢測食品污染物常用的檢測方法之一[10-12]。

抗體是建立免疫學(xué)快速檢測方法的核心試劑，由于ZIL和其他β2AR在結(jié)構(gòu)上的巨大差異，要檢測食品污染物中ZIL的殘留，則需要制備應(yīng)用于ZIL檢測的特異性抗體，而ZIL完全抗原的制備是獲得ZIL抗體和建立免疫學(xué)檢測方法的重要前提[13]。因此，本研究通過制備ZIL完全抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得抗ZIL高特異性和高靈敏度多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb)，為后期建立ZIL免疫學(xué)快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，由新鄉(xiāng)學(xué)院動物疫病分子診斷河南省工程實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 ZIL、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)、特布他林(terbutaline,TBL)、溴布特羅(brombuterol，BRO)、西馬特羅(cimaterol,CIM)、CLB、鹽酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DH)、RAC、達氟沙星(danofloxain,DAN)、泰樂菌素(tylosin,TYL)標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)、嗎啉乙磺酸(monohydrate,MES)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)德國Sigma公司產(chǎn)品；HRP-羊抗兔IgG，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；4-溴丁酸乙酯、無水碳酸鉀、丙酮、乙酸乙酯，上海有朋化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(Enspire)和蛋白電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra Cell 1658001)，美國Bio-Rad司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10 digitalV)、加熱磁力攪拌器(CMAGHS4)，德國IKA公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(UV-3010)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；透析袋(MD25)，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 齊帕特羅半抗原的修飾及改造 將1g ZIL鹽酸鹽添加到20 mL的NaOH溶液中(pH>10)，并用乙酸乙酯萃取ZIL游離堿。將得到的產(chǎn)物溶于50 mL丙酮后，加入4-溴丁酸乙酯和碳酸鉀回流，過濾除去碳酸鉀，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)丙酮。然后，用乙醇和KOH水溶液回流，將酯轉(zhuǎn)化為游離酸，并用液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)進行鑒定。

1.2.2 齊帕特羅完全抗原的合成及鑒定 將1.2.1得到的產(chǎn)物全部溶于2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸(MES)中，加50 mg EDC和20 mg NHS，室溫攪拌反應(yīng)2 h即為A液，并將溶液分成2份。然后，將20 mg BSA和20 mg OVA分別溶解于MES中，4℃冷藏即為B液。將A液緩慢滴加至B液中，室溫攪拌2 h，用0.01 mol/L的PBS溶液透析3 d，每天換液6次，收集透析后的產(chǎn)物后，分裝凍存于-80℃冰箱，具體合成路線見圖2。

圖2 齊帕特羅完全抗原合成路線圖

1.2.3 齊帕特羅完全抗原的鑒定 參考本實驗室前期研究方法[14-15]，根據(jù)Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書對偶聯(lián)后的產(chǎn)物進行濃度測定后，分別采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和紫外掃描(ultraviolet scanning,UV)鑒定完全抗原的合成情況。SDS-PAGE檢測時，濃縮膠濃度為50 g/L，分離膠濃度為150 g/L，電泳電壓為200 V，最后用考馬斯亮藍染色。UV鑒定完全抗原時，先用PBS稀釋BSA、OVA和ZIL標(biāo)準(zhǔn)溶液，并調(diào)整濃度與ZIL-BSA、ZIL-OVA的濃度一致，約為1 mg/mL。然后采用光譜掃描模式獲得上述溶液在200 nm～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜圖。

1.2.4 齊帕特羅多克隆抗體的制備 選擇健康的新西蘭大白兔2只，體重約1.5 kg左右，免疫劑量為500 μg，1 mL/只，首次免疫用等體積的弗氏佐劑進行乳化，乳化完全后進行背部皮下多點注射。從第2次免疫開始，用弗氏不完全佐劑進行乳化，每隔20 d免疫1次，共免疫5次。最后1次免疫后10 d，耳緣靜脈取血2 mL，37℃放置2 h后，4℃過夜，6 000 r/min離心5 min，抽取血清，分裝后，置-20℃保存。

1.2.5 齊帕特羅多抗血清的效價檢測 采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)評估免疫后的血清效價。基本步驟如下：(1)包被：將包被原(ZIL-OVA)用包被緩沖液(CBS，0.01 moL/L，pH=9.6)稀釋到2 μg/mL，50 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜；(2)洗滌：次日，甩干孔內(nèi)液體，先用PBST清洗5次，第5次靜置5 min，隨后在吸水紙上拍干；(3)封閉：每孔加入200 μL封閉液(50 g/L脫脂奶粉-PBST)，于37℃恒溫箱中孵育2 h，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(4)一抗孵育：先在每孔加入50 μL的PBS，然后在第1孔加入1∶100倍稀釋的50 μL的抗血清并進行倍比稀釋，完成后于37℃恒溫箱中孵育40 min，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(5)加入二抗：以辣根過氧化物酶(peroxidase)HRP標(biāo)記的羊抗兔-IgG作為二抗，用封閉液1∶5 000稀釋，50 μL/孔，于37℃恒溫箱中孵育30 min，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次，方法同上；(6)顯色：顯色液為TMB單組分顯色液，50 μL/孔，37℃避光10 min后，立即加入50 μL/孔的終止液；(7)讀數(shù)：酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光值。(8)判斷標(biāo)準(zhǔn)：以O(shè)D450nm值>0.3且P/N>3.1判斷兔血清產(chǎn)生的效價反應(yīng)層度。待效價符預(yù)期后，用500 μg 進行超免，7 d后進行心臟大量釆血，得到ZIL抗血清。

1.2.6 齊帕特羅多抗血清半數(shù)抑制濃度的測定 采用間接競爭ELISA評估多抗血清的半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory concentration,IC50)?；静襟E如下：(1)包被：將包被原(ZILL-OVA)用包被緩沖液稀釋到2 μg/mL，100 μL/孔加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜。(2)封閉：甩去孔內(nèi)液體，PBST-5%脫脂奶粉洗滌5次，每次3 min；每孔加入200 μL封閉液，于37℃恒溫箱中孵育2 h，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次。(3)競爭反應(yīng)：將0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液稀釋成系列濃度，50 μL/孔加入到已包被抗原的酶標(biāo)板中；再依次加入稀釋至合適濃度的50 μL/孔抗血清，37℃反應(yīng)90 min，洗滌5次，甩干。(4)加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL 5 000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG，37℃反應(yīng)60 min，洗滌5次，甩干。(5)顯色：每孔加顯色液100 μL，室溫避光顯色15 min，加入50 μL/孔終止液終止反應(yīng)。(6)測定：酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光值。(7)計算：使用Origin 9.0軟件中的四參數(shù)擬合函數(shù)對數(shù)據(jù)進行擬合，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以吸光值B/B0作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)IC50=(ZIL抗血清效價-ZIL抗血清抑制)/ ZIL抗血清效價×100%進行計算。

1.2.7 齊帕特羅多抗血清的特異性鑒定 選取瘦肉精類小分子CL、RAC、SAL、DH、BRO、BAM、CIM、TBL和2種臨床抗菌藥物DAN、TYL作為抑制物，評價該方法的特異性。按步驟1.2.6測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按公式交叉反應(yīng)率(CR)=IC50(標(biāo)準(zhǔn)品)/ IC50(反應(yīng)物)×100%計算相對應(yīng)的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果

2.1 齊帕特羅丁酸鹽的合成

為在ZIL分子結(jié)構(gòu)上引入-COOH，將ZIL與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)即得到ZIL-丁酸鹽。HPLC-MS鑒定結(jié)果表明，如圖3A所示，在反應(yīng)體系中檢測到2種主要產(chǎn)物，保留時間(RT)分別為11.48 min和12.94 min。其中RT值為11.48的分子質(zhì)量348.217 3 u(圖3B)，RT為12.94的分子質(zhì)量290.014 4 u(圖3C)。經(jīng)質(zhì)譜(MS)鑒定結(jié)果顯示，RT值為11.48的分子質(zhì)量與ZIL-丁酸鹽的分子量完全相符，約占體系中總反應(yīng)產(chǎn)物的92.23%(表1)，以上結(jié)果表明成功合成ZIL-丁酸鹽。

A.HPLC分離結(jié)果；B.樣品的MS檢測結(jié)果；C.樣品的MS檢測結(jié)果

2.2 齊帕特羅完全抗原的鑒定

2.2.1 SDS-PAGE鑒定 如圖4和圖5所示，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，ZIL-丁酸鹽與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)后的產(chǎn)物的分子質(zhì)量分別為66 ku和45 ku，相比BSA和OVA均有所增加，并且偶聯(lián)后產(chǎn)物的遷移速率明顯小于載體蛋白BSA或OVA，可初步證明ZIL與載體蛋白偶聯(lián)成功。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.BSA載體蛋白；2.偶聯(lián)產(chǎn)物

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.OVA載體蛋白；2.偶聯(lián)產(chǎn)物

2.2.2 紫外(UV)掃描鑒定結(jié)果 為進一步鑒定完全抗原是否制備成功，UV結(jié)果顯示，載體蛋白BSA和OVA的最高吸收峰分別為276 nm 和278 nm，小分子ZIL的最高吸收峰約為225 nm，而偶聯(lián)后的ZIL-BSA和ZIL-OVA的最高吸收峰分別為282 nm和275 nm。因此，相對于載體蛋白BSA/OVA，偶聯(lián)產(chǎn)物在200 nm～500 nm波長范圍特征吸收峰明顯不同，ZIL-BSA特征吸收峰發(fā)生明顯右移(圖6A)。雖然ZIL-OVA在268 nm～281 nm處的吸光值沒有明顯變化，其450 nm吸光值波動范圍在0.6207～0.6212之間，最大吸光值在275 nm處，為0.6271。因此，ZIL-OVA的特征吸收峰均發(fā)生了明顯左移(圖6B)。以上結(jié)果進一步證明ZIL與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)成功。

A.ZIL-BSA紫外掃描鑒定結(jié)果；B.ZIL-OVA紫外掃描鑒定結(jié)果A.ZIL-BSA UV scanning identification results; B.ZIL-OVA UV scanning identification results

2.3 齊帕特羅多抗血清效價檢測

第5次免疫后，通過對2只新西蘭大白兔耳緣靜脈采血，采用間接ELISA檢測血清抗體效價。如表2所示，以O(shè)D450nm值>0.3且P/N>3.1為判斷標(biāo)準(zhǔn)。相比于陰性兔血清，2只兔子均產(chǎn)生了良好的抗體效價，其中1號兔在第5次免疫后效價最高，達到1∶12 800，2號兔效價約為1∶6 400，說明完全抗原免疫后具有良好的免疫效果。

表2 間接ELISA檢測兔血清抗體效價結(jié)果

2.4 齊帕特羅多抗血清的IC50測定

為鑒定ZIL抗血清靈敏度，間接競爭法ELISA檢測結(jié)果顯示，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度良好，1號兔和2號兔血清標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2值分別為0.999 75和0.998 95(圖7)。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出1號和2號兔血清IC50值分別為0.38 ng/mL和1.13 ng/mL。由于1號兔血清敏感性較好，因此選擇1號兔血清用于后續(xù)試驗，經(jīng)計算1號兔血清IC20-IC80值為0.054 ng/mL～1.554 ng/mL。

2.5 抗體的特異性測定

為進一步鑒定ZIL抗血清的特異性，共選取了7種β2AR激動劑和2種獸用標(biāo)準(zhǔn)品與ZIL抗血清進行反應(yīng)。結(jié)果如表3所示，ZIL抗血清與CL、RAC、SAL、DH、BRO、BAM、CIM、TBL等7種常見β2AR激動劑均無交叉反應(yīng)，并且與2種獸藥DAN、TYL也無交叉反應(yīng)，其IC50值均高于1 000 ng/mL。

圖7 1號兔和2號兔血清敏感度標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

ZIL屬于小分子半抗原，不具備免疫原性，只有與相應(yīng)載體蛋白偶聯(lián)后才能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在合成完全抗原時，半抗原必須經(jīng)過合理的設(shè)計以獲得較好的特異性[14-15]。本研究將ZIL與4-溴丁酸乙酯進行反應(yīng)，最終使丁酸酯連接物的游離羧基被激活，使ZIL小分子被修飾成為ZIL-丁酸鹽，使之能與目標(biāo)蛋白的氨基偶聯(lián)[13]。為鑒定修飾后小分子是否改造成功，用HPLC-MS技術(shù)鑒定了小分子ZIL改造后的分子質(zhì)量和純度，其結(jié)果表明，分子質(zhì)量為348.91 u的化合物為主要產(chǎn)物，約占整個反應(yīng)體系產(chǎn)物的92.23%，與預(yù)期結(jié)果完全相符，表明成功引入了-COOH，獲得了ZIL-丁酸鹽。

表3 ZIL抗血清的特異性鑒定

為獲得ZIL-BSA/OVA完全抗原，首先對ZIL化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了分析，其包含3個親核基團，分別為仲醇、仲胺和苯并咪唑酰胺，它們有可能取代4-溴丁酸乙酯上的溴原子。但與脂肪族或苯并咪唑類硝基物相比，ZIL仲醇基的反應(yīng)活性要小得多。由于仲胺具有較大的旋轉(zhuǎn)空間位阻，因此ZIL和4-溴丁酸乙酯最可能的反應(yīng)位點是苯并咪唑部分上的仲胺[13,16]。另外，從設(shè)計的角度考慮，在仲胺或酰胺的基礎(chǔ)上都有可能產(chǎn)生合適的半抗原。因此，在ZIL-丁酸鹽的基礎(chǔ)上，本研究通過EDC/NHS方法，將其與載體蛋白BSA/OVA分別進行偶聯(lián)。SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果表明，相比于載體蛋白，偶聯(lián)后的分子質(zhì)量均明顯增加，且泳動速率明顯變慢，初步證實成功制備了完全抗原ZIL-BSA/OV。UV結(jié)果進一步表明，偶聯(lián)后的ZIL-BSA/OVA最大吸收峰明顯發(fā)生變化，同時具備小分子ZIL和載體蛋白BSA/OVA的分子特征，進一步證實成功制備了完全抗原ZIL-BSA/OVA。

此外，從引入的側(cè)鏈長度分析，與載體蛋白質(zhì)結(jié)合的-COOH和ZIL分子之間的3個碳原子的距離完全可以滿足和載體蛋白的有效偶聯(lián)，并能適當(dāng)暴露ZIL分子抗原表位，以提高抗體的特異性[13]。通過免疫新西蘭大白兔后，成功制備了高特異性和高靈敏度抗ZIL多抗血清，其效價在1∶6 400以上， IC50分別為0.38 ng/mL和1.13 ng/mL，并且與7種常見的“瘦肉精”類小分子和2種臨床常用抗菌藥物均無交叉反應(yīng)。更為重要的是，獲得的ZIL pAb均沒有與常見的“瘦肉精”(如CLB、RAC、SAL)發(fā)生任何交叉反應(yīng)。因為與這些常用“瘦肉精”的任何一種產(chǎn)生交叉反應(yīng)，都有可能導(dǎo)致在檢測過程中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

此外，ZIL抗體具有高特異性的主要原因還可能與ZIL屬于苯乙醇胺激動劑有關(guān)，由于其具有獨特的苯并咪唑核，在結(jié)構(gòu)上與其他苯乙醇胺激動劑完全不同，這也可能是抗體具有高特異性的另一個重要原因。Shelver WL等[13]采用相似的方法制備了山羊源抗ZIL的pAb，雖然與其他β2AR也無交叉反應(yīng)，但是其IC50=3.94 ng/mL，相比而言，本研究制備的兔源ZIL抗體具備更好的靈敏度。通過本實驗室前期對CLB、CIM、SAL、TBL等不同小分子研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)即使是同一種抗原，甚至是同一批制備的完全抗原免疫小鼠和兔子后，產(chǎn)生的免疫效果均存在很大差異。但是從整體情況分析，同種抗原免疫兔子后獲得的血清敏感度較好，IC50較低，并且效價較好。因此，相比Shelver WL等研究，我們推測本研究獲得的兔抗ZIL pAb IC50較低的原因，可能是相比于其他動物，與兔子免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，本研究利用ZIL與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)，再通過與載體蛋白BSA/OVA偶聯(lián)后，成功制備了ZIL完全抗原ZIL-BSA/OVA，免疫新西蘭大白兔后，獲得一種高靈敏度和高特異性的抗ZIL pAb，為后續(xù)建立ZIL免疫學(xué)快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。