齊海亮 楊陽 史雪娟 李亞齋

食管癌是世界范圍內(nèi)第九高發(fā)的惡性腫瘤，每年約有60萬人被診斷為食管癌，發(fā)病率為5.9/10萬，而且在中國的發(fā)病率更高，達(dá)12.6/10萬[1]。其中，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是最常見的病理類型，占所有食管癌的90%以上[2]。近年來，隨著對重點(diǎn)人群早期篩查的普及和治療技術(shù)的提高，部分早期ESCC患者可以長期存活，但由于腫瘤復(fù)發(fā)、廣泛浸潤和轉(zhuǎn)移等原因，ESCC的5年生存率仍低于13%[3]。盡管有大量研究報(bào)道了如抑癌基因腫瘤蛋白 p53（the tumor suppressor gene,the tumor protein p53,TP53）、磷脂酰肌醇激酶-3催化亞基α（phosphatidylinositol kinase-3 catalyzes the Subunit,PIK3CA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）和鼠肉瘤病毒致癌基因（mouse sarcoma virus oncogene,KRAS）在內(nèi)的多個(gè)基因突變在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但ESCC的驅(qū)動(dòng)基因仍不明確。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是非編碼RNA的新成員，由于circRNA的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)使其可以免受RNA酶降解，因此具有高度穩(wěn)定性。隨著對circRNA功能的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的circRNA在許多惡性腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、治療抵抗等方面起重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA漿細(xì)胞瘤變體易位1（plasmacytoma variant translocation 1,circPVT1）表達(dá)增高參與喉癌、胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡調(diào)控[5-6]，但circPVT1在ESCC中的表達(dá)及作用尚不明確。基于此，本研究通過檢測ESCC患者腫瘤組織與相應(yīng)癌旁組織及購買的ESCC細(xì)胞中circPVT1的表達(dá)情況，分析circPVT1與患者臨床病理特征的關(guān)系，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA以敲低circPVT1的表達(dá)，探討circPVT1對ESCC細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床組織標(biāo)本 收集2017年9月至2019年12月在河北省胸科醫(yī)院胸外科明確診斷，且行手術(shù)治療的40例ESCC患者的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織?；颊吣?2例，女18例；年齡42～78歲，中位年齡60歲。患者術(shù)前均未行放療、化療、生物治療。依據(jù)患者年齡分為＜60歲19例，≥60歲21例；依據(jù)WHO腫瘤病理學(xué)分級分為高中分化17例，低分化23例；依據(jù)淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移分為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）25例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N+）15例；依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control,UICC）第8版食管癌TNM判定標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期14例。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者知情并同意。

1.1.2 細(xì)胞 正常食管上皮細(xì)胞HEEC及ESCC細(xì)胞ECA-109由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)饋贈(zèng)；將細(xì)胞置于含有10%FBS及青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)80%融合，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。根據(jù)細(xì)胞密度分裝到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；FBS（美國 Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒（上海貝博生物公司）；RNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）；熒光定量 PCR 試劑盒（Syber green mix）（美國 Invitrogen公司），增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）單克隆抗體（美國Proteintech公司），B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）單克隆抗體（美國Proteintech公司），β-actin單克隆抗體（美國Proteintech公司）。引物設(shè)計(jì)及短發(fā)夾環(huán)狀RNA sh-circPVT1、sh-control（陰性對照）合成由上海吉瑪公司完成。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本處理 將切下的病變食管組織標(biāo)本在半小時(shí)內(nèi)避開腫瘤壞死區(qū)取腫瘤組織及距離腫瘤組織邊緣2 cm以選的正常組織，剪切至大小約1 cm3的組織塊，放入液氮中速凍2～3 min，然后保存于-80℃液氮罐中。

1.2.2 ESCC組織與癌旁組織、ECA-109細(xì)胞與HEEC細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平檢測 參照RNA提取試劑盒說明書方法提取組織和細(xì)胞的總RNA。RNA純度和濃度應(yīng)用Nanodrop核酸定量儀進(jìn)行檢測，符合純度和濃度要求的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取5 μg總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書建立 20 μl反轉(zhuǎn)錄體系合成 cDNA。qRT-PCR在美國Applied Biosystems公司PCR儀上進(jìn)行。cDNA按照1∶10稀釋，反應(yīng)體系如下：SYBRRGreen qPCR 預(yù)混液 10 μl，cDNA 2 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物0.5 μl，去離子水7 μl，離心混勻后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。相對定量法采用比較Ct法，以線性GAPDH作為內(nèi)參，采用ΔCt（Ct目的-Ct內(nèi)參）法進(jìn)行相對定量分析，采用2-ΔCt計(jì)算所得值作為目的RNA的相對表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行，具體如下：ECA-109細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶或96孔板中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，首先將無血清DMEM分別與sh-circPVT1、sh-control混合，同時(shí)將DMEM與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合，常溫放置5 min，隨后將DMEM/sh-circPVT1混合液及DMEM/sh-control混合液分別與DMEM/Lipofectamine 2000混合液相混合，短暫震蕩混勻后于室溫靜置15 min。同時(shí)ECA-109細(xì)胞無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行換液，后將上述兩種混合液分別加入細(xì)胞中，放入培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h，棄去細(xì)胞中的培養(yǎng)基，更換為新的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～72 h，收集轉(zhuǎn)染后的兩種細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平檢測 方法同1.2.2。

1.2.5 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞增殖情況檢測 采用CCK-8法。將ECA-109細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/100 μl，按1.2.3的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后 0、12、24、48、72 h進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。轉(zhuǎn)染成功后，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CCK-8試劑10 μl，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置2 h。取出96孔板，酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm處的吸光度（optical density,OD）值，并通過下列公式計(jì)算細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450）/（對照組OD450-空白組OD450）。

1.2.6 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞凋亡情況檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將ECA-109細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，按1.2.3的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞；冰PBS洗滌細(xì)胞2次后加入100 μl 1×Binding Buffer將細(xì)胞懸浮于EP管中，后每個(gè)EP管中快速加入5 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂蛋白V（Annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC）染液及 5 μl碘化丙啶（propidium iodide,PI）染液，混合均勻室溫避光孵育15 min，轉(zhuǎn)移到專用試管中，加入 3 200 μl 1×Binding Buffer，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率（%）=（Q2象限細(xì)胞總數(shù)+Q4象限細(xì)胞總數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞PCNA、BCL-2蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集細(xì)胞，提取總蛋白。取等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢，取出凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢，取出PVDF膜，放置在含5%脫脂奶粉的TTBS封閉液中，于室溫封閉2 h，將封閉后的PVDF膜用TTBS適當(dāng)洗脫，然后放入用一抗稀釋液稀釋的一抗中，4℃放置過夜。次日，取出PVDF膜用TTBS洗膜5～6次，將PVDF膜置入用適當(dāng)TTBS稀釋的化學(xué)發(fā)光二抗中，室溫反應(yīng)2 h，取出PVDF膜用TTBS適當(dāng)洗脫。最后用化學(xué)發(fā)光儀檢測抗體特異結(jié)合條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織與癌旁組織、ECA-109細(xì)胞與HEEC細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平比較 ESCC組織與癌旁組織circPVT1 表達(dá)水平分別為 1.42±0.84、0.94±0.51，ESCC組織circPVT1表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05）。ECA-109細(xì)胞與HEEC細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平分別為 0.73±0.36、0.44±0.21，ECA-109 細(xì)胞 circPVT1 表達(dá)水平高于HEEC細(xì)胞（P＜0.05）。即circPVT1在ESCC組織及細(xì)胞株中的表達(dá)均上調(diào)。

2.2 不同臨床病理特征的ESCC患者circPVT1表達(dá)情況比較 以circPVT1表達(dá)水平中位數(shù)1.40為界，ESCC患者分為circPVT1高表達(dá)（≥1.40）18例和低表達(dá)（＜1.40）22例。統(tǒng)計(jì)分析顯示，circPVT1的表達(dá)與患者腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），但與患者年齡、性別、腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.05）。即TNM分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC患者circPVT1表達(dá)上調(diào)，見表1。

表1 不同臨床病理特征的ESCC患者circPVT1表達(dá)情況比較[例（%）]

2.3 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平分別為 0.43±0.22、0.99±0.64，轉(zhuǎn)染 sh-circPVT1 的 ECA-109細(xì)胞circPVT1表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞降低（P＜0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1 與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞增殖率比較 轉(zhuǎn)染 12、24、36、48、72 h后，轉(zhuǎn)染sh-circPVT1的ECA-109細(xì)胞增殖率均低于轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞（P＜0.05），見表2。

表2 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞增殖率比較（%）

2.5 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞凋亡率比較 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的 ECA-109細(xì)胞凋亡率分別為（17.49±4.14）%、（5.49±0.95）%，轉(zhuǎn)染sh-circPVT1的ECA-109細(xì)胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞（P＜0.05）。即在ECA-109細(xì)胞中敲低circPVT1能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.6 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞PCNA、BCL-2蛋白表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)水平分別為 1.14±0.75、1.72±0.94，BCL-2 蛋白表達(dá)水平分別為 1.51±0.67、0.82±0.52，蛋白表達(dá)電泳圖見圖1。與轉(zhuǎn)染陰性對照相比，轉(zhuǎn)染sh-circPVT1的ECA-109細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），BCL-2蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。

圖1 轉(zhuǎn)染sh-circPVT1與轉(zhuǎn)染陰性對照的ECA-109細(xì)胞PCNA、BCL-2蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

circRNA作為非編碼RNA家族中的重要成員，廣泛存在于真核生物中。上世紀(jì)70年代circRNA被首次被報(bào)道，但當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是RNA剪切錯(cuò)誤所形成的錯(cuò)誤產(chǎn)物而未得到重視。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展及對circRNA的研究深入，越來越多的circRNA被鑒定出來，同時(shí)其在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用也被重新發(fā)現(xiàn)和重新評價(jià)，重要的是研究也證實(shí)circRNA在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮了不可或缺作用[7-8]。從生成上說，circRNA由其母體基因mRNA加工過程中通過反向剪切而成，根據(jù)其來源不同circRNA可分為3類，包括外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA和外顯子內(nèi)含子circRNA；從結(jié)構(gòu)上說，circRNA為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏3'polyA尾巴和5'端帽子結(jié)構(gòu)，可以免受核酸外切酶RNase R的降解，因此比相應(yīng)的線性RNA更穩(wěn)定，同時(shí)circRNA具有組織特異性，能夠在體液及胞外囊泡中檢測到，這些特性使得circRNA有了作為新的生物標(biāo)志物的可能；從功能上說，circRNA最重要的功能是作為內(nèi)源性競爭RNA，吸附微小RNA進(jìn)而影響微小RNA對下游靶基因的調(diào)控，間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)；另外circRNA更多的功能也在逐漸被發(fā)現(xiàn)，例如可以和RNA結(jié)合蛋白相互作用，轉(zhuǎn)錄調(diào)控甚至編碼小肽[9-12]。

隨著對 circRNA功能研究深入，越來越多的證據(jù)證實(shí)表達(dá)異常的circRNA參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、代謝等過程，并在預(yù)后評價(jià)及治療效果預(yù)測中發(fā)揮不可或缺的作用，其中包括ESCC。例如，在ESCC組織和細(xì)胞中circNTRK2表達(dá)明顯升高，高表達(dá)的circNTRK2與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。敲低circNTRK2可抑制ESCC細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，而circNTRK2的過表達(dá)則顯示相反的作用[13]。另外，Wang 等[14]也證實(shí)，circGSK3β在ESCC中高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)與ESCC患者所處的臨床階段和不良預(yù)后呈正相關(guān)。有研究也發(fā)現(xiàn)，circGSK3β通過與其母基因GSK3β直接相互作用，并通過抑制GSK3β活性促進(jìn)ESCC細(xì)胞遷移和侵襲[15]；此外，Pan等[16]通過測序發(fā)現(xiàn)有153 circRNA在ESCC組織和細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，并證實(shí) hsa_circ_0006948的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良呈正相關(guān)。從功能上講，hsa_circ_0006948在體外和體內(nèi)均促進(jìn)了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為治療ESCC提供了新的靶向治療位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，ESCC組織和細(xì)胞中circPVT1的表達(dá)較正常組織及細(xì)胞明顯上調(diào)，并且通過與患者臨床病理特進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TNM分期晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC患者中circPVT1的表達(dá)明顯上調(diào)，提示circPVT1的高表達(dá)可能與患者的臨床分期有關(guān)。

circPVT1位于染色體8q24.19上，由癌基因PVT1基因的外顯子環(huán)化而成，首先在胃癌中發(fā)現(xiàn)及報(bào)道，通過高通量測序檢測了胃癌組織及癌旁組織中的circRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)circPVT1在胃癌組織中明顯升高，高表達(dá)circPVT1的患者總生存率及5年無病生存率明顯減低；進(jìn)一步功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)circPVT1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制為circPVT1通過吸附miR-125而實(shí)現(xiàn)[5]。circPVT1通過充當(dāng)miR-205-5p的海綿，進(jìn)而調(diào)控了miR-205-5p的靶基因c-FLIP的表達(dá)參與了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[17]。有研究顯示，mut-p53/YAP/TEAD復(fù)合體可增強(qiáng)circPVT1的表達(dá)，而circPVT1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中也充當(dāng)致癌基因，由于TP53是人類癌癥中最常見的突變基因，因此有理由推測circPVT1在其他類型的癌癥中也可能起重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，在ESCC細(xì)胞中敲低circPVT1能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，證實(shí)circPVT1在ESCC中也發(fā)揮了癌基因的作用，為靶向治療ESCC提供了新的生物學(xué)標(biāo)記。

綜上所述，ESCC組織中circPVT1表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)circPVT1和腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在ESCC細(xì)胞中敲低circPVT1能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，circPVT1在ESCC中發(fā)揮癌基因的作用。這或?yàn)橹委烢SCC提供了新的分子生物學(xué)靶標(biāo)。